蔡英，黄慧玲，范维佳，武俏丽，李晓茜，苏彦华，温晓昶

重型颅脑创伤大鼠后期脑水肿研究及牛磺酸转运体的作用

蔡英，黄慧玲△，范维佳，武俏丽，李晓茜，苏彦华，温晓昶

目的 研究牛磺酸转运体（TauT）在牛磺酸调节重型颅脑创伤大鼠后期脑水肿中的作用。方法 将40只大鼠按随机数字表法分为4组:假手术组（Sham组）、脑外伤组（TBI组）、牛磺酸预防组（Pre-Tau组）和牛磺酸治疗组（Tau组）。液压冲击法制作重型颅脑创伤大鼠模型。Pre-Tau组和Tau组分别在造模前或后给予120 g/L的牛磺酸溶液，其他两组给予等量的等渗生理盐水。7 d后用干湿重法检测脑组织中脑水含量，实时荧光定量PCR和Western Blot方法检测TauT和水通道蛋白（AQP4）的mRNA表达及蛋白含量。结果 与Sham组相比，TBI组脑水含量、AQP4的mRNA和蛋白表达水平均显著升高，TauT的mRNA和蛋白表达水平显著降低。与TBI组比较，Pre-Tau组和Tau组脑水含量、AQP4的mRNA和蛋白表达水平显著降低、TauT的mRNA表达明显升高；Tau组TauT的蛋白表达明显升高；Pre-Tau组TauT的蛋白表达有所升高，但差异无统计学意义。AQP4的mRNA和蛋白表达水平与脑水含量呈正相关（r分别为0.621和0.457），AQP4的mRNA与蛋白表达亦呈正相关（r=0.459）。结论 牛磺酸通过提高重型颅脑创伤大鼠后期TauT的表达水平，降低脑水含量和AQP4的表达，发挥神经元保护作用。

牛磺酸；脑损伤；膜转运蛋白质类；脑水肿；水通道蛋白质4；大鼠，Sprague-Dawley；牛磺酸转运体

牛磺酸（taurine，Tau）是神经系统发育、维持功能所不可缺少的氨基酸，具有抑制性递质的作用［1-2］。细胞内高浓度的牛磺酸水平是其发挥作用的基础，牛磺酸转运体（taurine transporter，TauT）逆浓度梯度将血浆中牛磺酸跨膜主动转运至细胞内聚集是形成细胞内高浓度牛磺酸的主要方式。重型颅脑创伤（severe traumatic brain injury，sTBI）是神经外科常见的疾病，具有很高的致死率和致残率［3］。脑水肿引起的颅内压增高是颅脑创伤后最重要的病理反应［4］。水通道蛋白4（AQP4）是哺乳动物脑内最主要的水通道蛋白，与脑脊液的产生和重吸收有关，在脑水肿的形成过程中起关键性作用［5-6］。本课题组前期研究发现，Tau具有显著改善颅脑创伤大鼠脑血流、血液凝固状态和代谢紊乱等脑保护作用［7］。本实验应用Tau治疗和预防TBI，观察TBI后期的脑水肿等情况，旨在进一步阐明Tau对TBI大鼠的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验用品

1.1.1 试剂 牛磺酸（美国Sigma公司），RNA提取试剂、荧光定量PCR扩增试剂盒、逆转录酶M-MLV和RNA酶抑制剂（美国Life Technologies公司），总蛋白提取试剂盒和BCA法蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司），羊抗TauT多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），兔抗AQP4抗体（美国Abcam公司），β-actin抗体（美国Biotech公司），HRP标记二抗（北京中杉金桥公司），ECL荧光化学发光试剂盒（美国Millipore公司）。其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器 DY-1型动物脑立体定位仪（天津市医疗器械研究所），液压脑创伤打击仪（美国弗吉尼亚大学），Strong 90型电动磨钻（韩国Sae Shin Precision公司），UNICAM UV 300型紫外分光光度计（美国Thermo公司），Avanti-30型台式高速低温离心机（美国Beckman公司），Miniprotean Tetra Cell型电泳系统、Mini Trans-Blot Cell型转膜系统和CFX384型实时荧光定量PCR仪（美国BIO-RAD公司），Gene genius型凝胶成像及分析系统（美国Syngene公司）。

1.1.3 实验动物 清洁级SD雄性大鼠40只，购自军事医学科学院实验动物中心［许可证号：SCXK-（军）2012-0004］，体质量（290±20）g。按照随机数字表法分为假手术组（Sham组）、脑外伤组（TBI组）、牛磺酸预防组（Pre-TBI组）和牛磺酸治疗组（Tau组），每组10只。实验中死亡或不符合标准的大鼠均重新造模补齐。

1.2 实验方法

1.2.1 颅脑创伤模型制作及分组 根据文献［7］的方法制作大鼠TBI模型：经腹腔注射水合氯醛麻醉动物，将头部固定于动物脑立体定位仪。头部消毒后正中切开2 cm，剥离骨膜，在颅骨前囟左后4.5 mm、矢状缝左旁2.5 mm钻一直径为5 mm的骨窗。将无菌打击管两端分别固定于骨窗和液压脑创伤打击仪的冲击嘴，调节压力为1.8个标准大气压，进行液压打击，制作重型颅脑创伤大鼠模型。

1.2.2 牛磺酸溶液的配制及给药 将2 400 mg牛磺酸溶于15 mL等渗盐水中，充分溶解后用NaOH调节pH值至7.0，定容为20 mL，制成120 g/L的牛磺酸溶液，在无菌室内经0.25µm滤器过滤后保存备用。Sham组，只开骨窗，不打击，尾静脉即刻注射0.5 mL等渗盐水，并连续注射7 d。TBI组，用液压打击仪制作sTBI模型，造模成功后，尾静脉即刻注射0.5 mL等渗盐水，连续7 d。Pre-Tau组和Tau组分别在造模前连续4 d或造模成功后连续7 d给予尾静脉注射牛磺酸溶液。

1.2.3 脑组织含水量测定 实验动物于7 d后断头处死，迅速在冰上取伤侧（左侧）大脑组织，将皮质表面软脑膜剔除干净，滤纸吸干表面水分及血渍，取损伤区前缘约30 mg脑组织称湿质量后放入电热恒温干燥箱内105℃烤24 h至质量恒定，称干质量（两次干质量差应＜0.000 2 g）。根据Eliot公式计算脑组织含水量：脑组织含水量=（湿质量-干质量）/湿质量×100%。剩余伤侧脑组织液氮研磨成粉末，-80℃冰箱保存备用。

1.2.4 实时荧光定量PCR法检测脑组织中TauT和AQP4基因表达量 按照TRIzol Reagent试剂说明书提取脑组织总RNA。用紫外分光光度计和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测其浓度、纯度和完整性。取2 μg总RNA按照逆转录酶MMLV说明书反转录成cDNA，-20℃冰箱保存备用。采用Gene Runner软件进行引物设计，经Blast检索无同源性，由北京Life Technologies生物技术公司合成。TauT基因引物序列：上游5′-418GAGGTCATCATAGGCCAGTAC438-3′，下游5′-537GTACACATTCAGGAGGGACAC507-3′，扩增产物为120 bp；AQP4引物序列为：上游5′-253GTTCAGTGCTTCGGCCACAT272-3′，下游5′-362GCAGTGATGTAGAAGACGGACTT340-3′，扩增产物为 110 bp；β-actin基因引物序列：上游 5′-410GAACCCTAAGGCCAACCGTG429-3′，下游5′-514AGGCATACAGGGACAACACAG493-3′，扩增产物为105 bp。用实时荧光定量PCR仪检测TauT和AQP4的mRNA表达，以β-actin为内参。20µL PCR反应体系为：10µL的2×SYBR GREEN MIX，上下游引物（10 μmol/L）各1µL，1µL的cDNA，补充ddH2O至20µL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性15 s，退火15 s，72℃延伸15 s，循环40次；最后72℃延伸5 min。TauT、AQP4和β-actin的退火温度分别为62℃、60℃和55℃。样本目的基因的相对表达量计算公式为：相对表达量=2-△Ct（△Ct=Ct1-Ct2；Ct1：样品待测基因的临界循环数；Ct2：样品管家基因的临界循环数）。

1.2.5 Western Blot法检测脑组织中TauT和AQP4蛋白表达量 按照总蛋白提取说明书抽提脑组织总蛋白：取500 mg液氮研磨的脑组织粉末放入匀浆器中球状部位，加入0.5 mL的总蛋白提取试剂，于匀浆器中进行匀浆。然后置于冰上。重复碾几次使组织尽量碾碎。裂解30 min后，用移液器将裂解液移至1.5 mL离心管中，然后在4℃下12 000 r/min离心5 min，取上清分装于0.5 mL离心管中并置于-20℃保存，此为提取的脑组织总蛋白。BCA法定量后用蛋白溶解液调整蛋白浓度为5 g/L，取40µg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），切取包含TauT（64 ku）、AQP4（34 ku）或β-actin（42 ku）的凝胶进行转膜，110 V，90 min，用5%脱脂奶粉封闭2 h，按照分子质量大小剪开硝酸纤维素（NC）膜后，分别加入TauT（1∶200）、AQP4（1∶500）或β-actin（1∶1 000）抗体，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次2 mL，洗涤5 min。加入HRP标记的二抗（1∶500）常温孵育2 h。弃掉二抗，再次TBST洗膜3次。加入1 mL ECL发光液与膜充分接触，于成像系统进行图像采集。样本中目的蛋白的相对表达量为目的蛋白条带与内参β-actin蛋白条带净吸光度值的比值。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0录入数据并进行统计学分析，数据均以±s表示，用Kolmogorov-Smirnov法检验数据的正态分布情况，如符合则采用单因素方差分析（Oneway ANOVA），多重比较采用LSD-t法，相关性分析采用Pearson相关分析法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑水含量检测 与Sham组相比，TBI组脑水含量显著升高，Pre-Tau组和Tau组脑水含量与TBI组比较明显降低（P＜0.05），见表1。

Tab.1 Water content，mRNA transcription and protein expression levels of TauT and AQP4 in injured cerebral hemisphere in all four groups表1 牛磺酸治疗后伤侧大脑组织脑水含量、TauT和AQP4的mRNA及蛋白表达情况（n=10，±s）

Tab.1 Water content，mRNA transcription and protein expression levels of TauT and AQP4 in injured cerebral hemisphere in all four groups表1 牛磺酸治疗后伤侧大脑组织脑水含量、TauT和AQP4的mRNA及蛋白表达情况（n=10，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与Sham组比较，b与TBI组比较，P＜0.05

?

2.2 AQP4和TauT的mRNA及蛋白表达 与Sham组相比，TBI组脑组织AQP4 mRNA及蛋白表达量显著升高，TauT mRNA及蛋白表达量均显著降低（P＜0.05）。与TBI组比较，Pre-Tau组和Tau组AQP4 mRNA及蛋白水平显著降低（P＜0.05）；Tau 组TauT mRNA及蛋白表达量比TBI组明显升高（P＜0.05），Pre-Tau组的TauT mRNA表达量明显升高（P＜0.05），见图1、表1。

2.3 AQP4 mRNA和蛋白表达与脑水含量的相关性分析 AQP4的mRNA和蛋白表达水平与脑水含量呈正相关（r分别为0.621和0.457，P＜0.05），AQP4 的mRNA与蛋白表达亦呈正相关（r=0.459，P＜0.05）。

Fig.1 TauT and AQP4 protein expression levels in the injured cerebral hemisphere in all four groups图1 牛磺酸治疗后伤侧脑组织TauT和AQP4蛋白表达

3 讨论

牛磺酸以毫摩尔量分布于脑组织中，通过TauT介导，选择性摄入和释放牛磺酸，发挥神经元保护功能。牛磺酸转运至细胞内可以被牛磺酸转运体抑制剂2-胍基乙磺酸（GES）所抑制，使细胞内的牛磺酸浓度大大降低［8］，TauT-/-小鼠的多个组织牛磺酸含量大大降低［9-10］。因此，牛磺酸作用的发挥依赖于TauT数量和结构的正常。本实验在sTBI后尾静脉注射牛磺酸可以有效诱导脑组织TauT的mRNA和蛋白表达，说明在病理情况下，外源性牛磺酸能够增强脑细胞膜上TauT的表达以维持细胞内Tau的生理浓度，与文献报道一致［11］。在本实验中，预防性地应用牛磺酸也可有效提高脑组织TauT的mRNA表达量，其机制可能是细胞外高浓度的牛磺酸使细胞处于一种“活化”的状态，能够随时对外界刺激如脑外伤做出应答以保护机体，这可能是机体的一种储备功能。Pre-Tau组TauT蛋白的表达与TBI组比较有升高的趋势，但是差异无统计学意义，其原因可能是大鼠在未受到TBI损伤时，给予尾静脉注射牛磺酸，虽然增加了血液中的牛磺酸浓度，使细胞处于一种“活化”的状态，但是并不能改变机体内TauT蛋白的正常水平。此时的大鼠在受到脑外伤时，停止了外源性牛磺酸溶液的供给，只能依靠“活化”的细胞诱导TauT mRNA的高表达，在TBI后翻译出大量的TauT蛋白，使血浆中的牛磺酸转运到细胞内，发挥牛磺酸的神经元保护作用，降低脑水肿。但细胞内高水平的牛磺酸可反馈性地抑制TauT的表达［12］，使预防组的TauT蛋白表达量下降。

AQP4作为脑组织内含量最为丰富的水通道蛋白，参与介导水分子的跨膜转运和离子平衡，在脑内水平衡的调节上起主要作用［13］，与脑水肿的发生密切相关。Qing等［14］检测了大鼠脑出血后脑水含量和脑组织AQP4 mRNA的表达情况，结果显示脑水含量和AQP4 mRNA在脑出血1 d即有升高，3 d达到峰值，7 d和14 d仍在高水平，且AQP4 mRNA的表达和脑水含量呈正相关关系。说明AQP4在脑水肿的形成过程中起重要作用。

国内外关于TBI后脑水肿的文献多集中在TBI后的早期即12 h、24 h、48 h或72 h［15-16］，TBI后期（7 d）的脑水肿情况少有报道。Oliva等［17］报道中度TBI 后7 d大鼠伤侧皮质AQP4的蛋白表达水平较Sham组显著下降，海马AQP4的蛋白表达水平没有显著性变化，而本研究结果显示重度TBI后7 d大鼠伤侧大脑半球的AQP4的蛋白表达水平较Sham组显著上升，与上述文献结果不同。其原因一是由于Oliva等的动物模型为中度TBI模型，本研究动物模型为重度TBI模型；二是检测部位不同，Oliva等分别检测伤侧的皮质和海马，本研究为伤侧大脑半球。这就说明AQP4在不同的实验模型、不同的组织部位具有不同的表达情况。

本研究结果显示，sTBI组的脑水含量与AQP4 的mRNA和蛋白表达都升高，说明AQP4参与了重型颅脑创伤性脑水肿的发生发展过程。牛磺酸预防与治疗可以有效降低TBI后7 d脑水含量与AQP4 的mRNA和蛋白表达量。这与笔者前期对脑外伤后早期24 h的研究结果一致［7］，说明牛磺酸具有防止TBI后脑水肿的作用。机制可能是TBI后继发创伤性脑水肿，引起细胞内外的渗透压不平衡，细胞外的高渗状态通过诱导牛磺酸转运体的表达［18］，使牛磺酸转运到细胞内。细胞内牛磺酸浓度升高不仅可以通过稳定细胞膜、清除自由基、抗脂质过氧化等功能来减轻脑水肿的程度，从而间接调节AQP4的mRNA和蛋白表达量；还可以通过某些环节抑制AQP4的转录和翻译过程，从而直接降低AQP4的mRNA和蛋白表达。

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（2015-01-08收稿 2015-03-05修回）

（本文编辑 魏杰）

Protection role of taurine transporter in rats brain edema followed severe traumatic head injury

CAI Ying，HUANG Huiling△，FAN Weijia，WU Qiaoli，LI Xiaoqian，SU Yanhua，WEN Xiaochang
Tianjin Huanhu Hospital，Neurosurgery Institute of Tianjin，Tianjin Cerebrovascular and Neurodegeneration Key Laboratory，Tianjin 300060，China
△Corresponding Author E-mail：huanghuiling@126.com

Objective To investigate the effect of taurine transporter in the process of protection of brain edema in rats with severe traumatic head injury.Methods A total of 24 Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 4 groups.Except the control rats（Group Sham），all other three groups were subjected to lateral fluid percussion head injury.The TBI （Traumatic brain injury）models（Group TBI）and surgical control rats（Group Sham）were injected with saline through caudal vein after surgery，while the Taurine prevention and Taurine treatment models（Group Pre Tau and Group Tau）were injected with 120 g/L taurine solution before or after surgeries respectively.Water content in each brain，mRNA and protein expression of aquaporin 4 and taurine transporter in the injured rat brain hemispheres were all evaluated over the time course of the study（7 d）in each group.Results Compared with rats in Group Sham，water content in each brain increase，mRNA transcription and protein expression of AQP4 were both up regulated but the mRNA transcription and protein expression of TauT were both down-regulated in rats in TBI group.Compared with rats in TBI group，brain water content，mRNA transcription and protein expression of AQP4 all decrease while mRNA transcription and protein expression of TauT all increase in rats in Pre tau and Tau groups.There is no statistical difference of TauT expression between rats in pre-tau group and Tau group.Conclusion Taurine exert its neuron protection role through draining water content from brain and down regulating expression of AQP4 but rising expression of TauT after TBI.

Taurine；brain injuries；membrane transport proteins；brain edema；aquaporin 4；rats，Sprague-Dawley；taurine transporter

R651.15

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.008

国家自然科学基金资助项目（30973089）；天津市应用基础及前沿技术研究计划项目（10JCYBJC23200）；天津市卫生局科技基金项目（2012KR09）

天津市环湖医院，天津市神经外科研究所，天津市脑血管与神经变性重点实验室（邮编300060）

蔡英（1978），女，硕士，助理研究员，主要从事神经系统损伤与修复方面研究

△E-mail：huanghuiling@126.com