李 宁 周素贞 李素云

河南中医学院第一附属医院，河南郑州 450008

肺癌是严重危害人类生命和健康的恶性肿瘤之一，也是世界范围内发病和死亡率最高的癌症[1]。SOX1，即 SRY (sex determining region Y)-box 1，属于具有high mobility group (HMG)-box结构的转录因子家族SOX家族的成员[2]。SOX1可以通过直接与β-catenin结合，导致β-catenin降解或直接抑制其功能，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路[3-4]。我们前期结果发现SOX1在肺癌组织中低表达，但机制尚不清楚[5]。最近研究人员发现，在肝癌、鼻咽癌、食管癌细胞等组织中SOX1启动子存在高甲基化，从而导致其表达缺[3，6，7]，SOX1 启动子甲基化在肺癌中尚未有报道。另外我们前期实验发现通过cDNA微阵列分析发现过表达SOX1后ECT2基因表达降低，本研究我们将探讨肺癌细胞中SOX1基因启动子甲基化情况以及SOX1是否直接调控ECT2的表达。

1 材料与方法

1.1 材料

50例原发性肺癌和癌旁组织由河南中医学院第一附属医院提供。5’-杂氮-2’-脱氧胞嘧啶购于Sigma公司，EpiTect Bisulfite Kit购于Qiagen，Wizard DNA Clean-Up System为Promega产品，胎牛血清和DMEM细胞培养基均购于Gibco公司，T载体购于Takara公司。

1.2 细胞来源及培养

肺癌细胞株A-1由本试验室冻存。在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置37℃ 5%CO2的培养箱中培养，2～3d换液一次，取对数生长期细胞进行试验。

1.3 DNA亚硫酸氢钠修饰

肺癌细胞株A-1由本试验室冻存。在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置37℃ 5% CO2的培养箱中培养，2～3d换液一次，取对数生长期细胞进行试验。

1.4 甲基化特异性PCR

用甲基化特异性PCR（MSP）检测SOX1在肺癌组织的甲基化状态。甲基化特异性引物设计参见文献[8]，PCR产物于2%琼脂糖凝胶上电泳，自动电泳凝胶成像分析系统扫描分析。

1.5 Realtime-PCR检测ECT2表达情况

培养A-1细胞至对数生长期，转染p-CMVSOX1或SOX1 siRNA，转染24h后Trizol 法提取总RNA，逆转录获得cDNA。……