卓微伟 张小蒙 李凤 李艳萍 王毅兵

(盐城卫生职业技术学院 江苏盐城 224005)

1 mRNA差异显示技术

1.1 mRNA差异显示技术的原理

mRNA差异显示技术是Liang和Pardee于1992年首次提出的[1]。它的原理是:因为真核细胞mRNA 3'端具有poly(A)结构,人工合成poly(T)引物即锚定引物与之配对并进行反转录,然后用相同的锚定引物和随机引物进行PCR扩增,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物,对含有差异的片段进行回收,再次扩增后克隆测序,从而获得cDNA,进而比较基因表达的差异。

1.2 mRNA差异显示技术的优点

所需实验技术简单,只运用了PCR和PAGE两项基本的分子生物学技术;需要初始RNA较少,因为低丰度的mRNA经过PCR扩增以后将会变得很多;可同时比较多组不同mRNA样品之间的基因差异表达情况;既可以分离在表达本质上存在差异的基因,又可以分离在表达产量上存在差异的基因。

1.3 mRNA差异显示技术的缺点

初始得到的差异片段较小,一般在300bp左右;得到的差异片段假阳性比较高,假阳性率高达70%;难以扩增低拷贝的mRNA,从而导致基因差异显示出现误差;由于3' 端引物的简并性,使得某些差异条带无法被扩增出来。得到的差异片段大多是3' 端非编码序列,可供利用的信息较少;

2 抑制性差减杂交

2.1 抑制性差减杂交的原理

抑制性差减杂交由Diatchenkot首先提出。它以杂交动力学和抑制性PCR为原理,利用同样条件下高丰度单链DNA分子与同源序列相配对的速度要大于低丰度单链DNA分子的特点,在试验组和驱动组的cDNA变性后再复性的过程中,使材料中原来存在表达量上差异的基因在经过PCR以后达到基本一致[2]。同时,由于试验组的cDNA在进行杂交之前加有不同的接头,当采用与两个不同接头序列互补的引物进行PCR扩增时,只有目标序列得到有效扩增,非目标序列退火时易产生类似“锅柄”的结构,无法与引物配对,扩增受到抑制。

2.2 抑制性差减杂交的的优点

操作相对简单,过程也并不复杂,仅需要两轮杂交且无需分离杂交过程中的复合体;该技术具有高度的灵敏性,即使丰度很低的片段也可以被检测出来;可同时分析大量基因的差异表达,具有高通量的特点;该技术在待测cDNA的两端加上了接头引物,在PCR扩增中提高了特异性,减少了假阳性;

2.3 抑制性差减杂交的缺点

对于无酶切位点或酶切位点较少的片段无法检测;无法检测非酶切位点区域内的突变、缺失或插入;起始样品浓度要求过高,不适于来源困难的样品;在SSH法的每一步骤完成后,均需对上一步骤进行验证,以确保后续步骤的顺利进行。

3 cDNA-AFLP

3.1 cDNA-AFLP的原理

cDNA-AFLP技术结合了DDRT-PCR和AFLP两项技术,其基本原理:以纯化的mRNA为模板,反转录合成cDNA,用识别序列分别为6bp和4bp的两种限制性内切酶酶切cDNA,酶切片段用适宜的接头进行连接,利用与接头序列互补的引物进行预扩增和选择性扩增,扩增产物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示。

3.2 cDNA-AFLP的优点

cDNA-AFLP具有较高的重复性;cDNA-AFLP对模板的质量和反应条件要求不高。

3.3 cDNA-AFLP的缺点

cDNA-AFLP依赖于cDNA上一个6bp的限制性酶切位点的存在。所以选择的内切酶应该能最大可能地酶解cDNA样品。理想的情况是每个cDNA样品中都有一个识别位点为6bp的内切酶的酶切位点,而在其一边或两边恰好有一个4bp的酶切位点。

4 基因表达系列分析

4.1 基因表达系列分析的原理

基因表达系列分析是一种高通量研究功能基因组的方法。理论上来说一个9bp的短核苷酸序列能够分辨262144个不同的转录物,所以理论上每一个9bp标签能够代表一种转录物的特征序列。因此考查这些小片段出现的频率就可以知道每一种mRNA的丰度[3]。

4.2 基因表达系列分析的优点

SAGE技术能够全面收集基因表达信息,覆盖面广,并且对这些信息进行系统海量的分析。

4.3 基因表达系列分析的缺点

一些低丰度的mRNA可能包含不进来;SAGE技术依赖于一个能够包含足够信息的9bp的碱基序列在对标签TAGs进行体外连接时可能会受到接头的干扰而引起误差。

5 结语

除了上述几种主要的方法以外,还有一些常用的如代表性差异分析、RNA指纹图谱技术、微阵列技术等新技术也在寻找分离新的基因中起到重要的作用。

另外,大量实践证明,以上所述的分离差异表达基因的方法各有自己的特点,应该根据研究材料的需要选择最合适的方法,还可以根据实际的需要将多种方法进行融合,未来随着各种技术的融合必将能建立一种能明确识别差异表达基因,且适合于检测低丰度mRNA的方法。

[1]Liang P, Pardee A B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction.Science, 1992, 257(5072): 967-971.

[2]Hubank M, Schatz D G.Identifying differences in mRNA expression by representional difference analysis of cDNA. Nucleic Acids Research,1994,22:5640-5648.

[3]Velculescu V E,Zhang L,Vogelstein B,Kinzler K W. Serial analysis of gene expression. Science,1995,270:484-487.

[4]张小芳,金梅.DDRT-PCR技术研究进展. 安徽农学通报, 2008,14(20):29-30.

[5]高雪.差异表达基因分离技术的研究进展. 生物技术通报, 2009,6:71-74.