马海波　（辽宁省桓仁县动物疫病预防控制中心　117200）

本溪地区猪蓝耳病的免疫及感染情况调查

马海波（辽宁省桓仁县动物疫病预防控制中心117200）

猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的一种免疫抑制性疾病。高致病性猪繁殖与呼吸综合征是由PRRSV变异株引起的一种急性高致病性传染病。仔猪发病率可达100%，死亡率高达50%，母猪流产率可达30%，育肥猪也可发病死亡。猪蓝耳病可造成猪的免疫抑制，导致其他病菌、病毒趁虚而入，引发多重感染，继而导致猪的免疫抑制进一步加剧，最终导致大量猪死亡，给中国养猪业造成巨大的经济损失

1　蓝耳病的基本情况

1.1流行及症状蓝耳病传入我国的时间不长。1995年从加拿大引进的种猪分离到PRRS病毒，1995年底华北地区猪场暴发，传播的速度非常快。1996～1998年我国出现流产风暴。1998年后，总体比较平稳缓和，呈零星暴发。高致病性蓝耳病疫病多发生于春末、夏初之高温季节，特别是在饲养环境恶劣，猪舍通风降温不良，炎热潮湿，饲养密度过大的散养户和小型猪场多发。被感染的猪呈现出的临床症状包括：高热（41～42℃），精神沉郁，食欲减退，卧地不起，皮肤发红，眼结膜炎、眼睑水肿；气喘、流鼻涕、咳嗽等呼吸症状；便秘、腹泻等消化系统紊乱；部分猪后躯无力，不能站立或共济失调等神经症状

1.2猪蓝耳病的危害一是使猪群的生产性能下降。二是猪瘟、伪狂犬、附红细胞体、链球菌、断奶多系统衰竭综合症、呼吸道疾病发病率上升，三是母猪发情障碍、滞后产现象增多。使免疫系统损害，免疫功能下降，易继发附红细胞体病、链球菌病、沙门氏菌病等，与其他病原（支原体、PCV-2、猪瘟、伪狂犬、流感等）形成多重感染，影响猪瘟疫苗的免疫效果。

1.3传播途径可通过多种途经传播，呼吸道是该病的主要感染途经，无临床症状而带毒猪可以传播本病，并可垂直传播。感染来源主要是：公猪精液、引种带毒、猪射针头、进入猪场的人和物、蚊蝇传播、运输车辆。持续感染或隐性感染非常普遍。猪持续性，隐性感染、带毒，很难清除；是导致呼吸道疾病突出的根本原因，是原发性感染的病原体；感染猪场在没有继发感染的情况下，猪群一般不会出现临床症状。单凭临床表现很难确诊。少有急性表现，以慢性、亚临床性为主，常表现为繁殖与生产性能下降，猪难养，易患病；散发性晚期流产。冬春季节易出现初产母猪繁殖障碍和晚期流产，经产母猪不时出现流产；常规的防控方法很难奏效。我国蓝耳病流行毒株已出现一些基因缺失的变易毒株。

2　调查材料与方法

2.1调查材料（1）取样：从32个商品代养殖场、54个散养户、16个种猪场共采集猪血样品1530份，分离血清，-20℃冻存备用；从2个屠宰场采集猪组织样品80份，-20℃冻存备用。（2）试剂；高致病性猪繁殖与呼吸综合征抗体检测试剂盒，4℃冰箱保存；高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测试剂盒，-20℃冰箱保存。（3）主要仪器及器材：精密移液器、酶标仪、恒温培养箱、电子天平、台式离心机、高速冷冻离心机、荧光定量、PCR仪（北京生科尚仪公司）、生物安全柜、电热鼓风干燥箱、电泳槽、紫外凝胶成像仪、组织研磨器。（4）检测方法：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、抗体检测分别采用RT-PCR、间接ELISA方法。

2.2方法 （1）抗体检测（ELISA）：①包被：用0.05M pH9碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。②加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1h。然后洗涤，同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。③加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1h，洗涤。④加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30min。⑤终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。（2）结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。（3）抗原检测（RT-PCR）：①称取猪组织0.5g于研磨器中，加少量的石英砂进行研磨，再加入1.5mlpH值为7.2的PBS液研磨，待匀浆后转至1.5mlEP管中，加入300μl变性液，混匀；取血清100μl置1.5mlEP管中，加入300μl变性液，混匀。取已处理的样品，分别做好标记，每管依次加入醋酸钠溶液（pH值为4.0）30μl，酚/氯仿/异戊醇混合液300μl，颠倒10次，混匀，置-20℃冰箱中10min，4℃离心，12000R/S，离心15min。取300μl上清液置于1.5mlEP管中，加入300μl异丙醇，混匀，置-20℃冰箱中30min。取出置离心机中4℃离心，12000R/S离心20min。弃上清液，沿管壁缓缓滴入1ml75%乙醇，轻轻旋转一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1min，自然风干（以无乙醇味为准）。将DEPC处理的灭菌去离子水与RAN酶抑制剂混合（按9:1比例配置）制成混合液，取10μl将病毒RAN溶解，取2μl用于RT-PCR反应模板。②RT体系的组成建立：反转录反应液16μl，RAN酶抑制剂1μl，反转录酶1μl，已溶解的病毒RNA2μl，总体积20μl。混匀放入PCR扩增管，在PCR扩增仪上进行以下循环，42℃60min，98℃5min，扩增完毕后备用。③PCR体系的组成建立：PCR反应液16μl，TapDNA聚合酶2μl，反转录产物2μl，总体积20μl。混匀，并加入20μl矿物油覆盖，放于PCR扩增仪上，按如下扩增程序扩增94℃30S，55℃30s×35循环，72℃30s，72℃5min。扩增完成后，取PCR产物进行电泳，检测扩增情况。

图1　抗原PCR扩增泳道1：阴性对照；泳道M：DNA分子maker；泳道2：阳新对照；泳道3～5：待检扩增产物

3　结果

3.1不同类型猪场猪蓝耳病的抗体结果由表1可知，16个种猪场，共240份血清，阳性数为220份，阳性率为92%；32个商品代猪场共480份血清，阳性数为350份，阳性率为73%；54个散养户共810份血清，阳性数为587，阳性率为72%。

表1　不同类型猪场猪蓝耳病的抗体阳性率　　 （%）

表2　不同地区猪场猪蓝耳病的抗体阳性率　　　 （%）

3.2不同地区猪场猪蓝耳病的抗体抗体检测结果由表2可知，三个地区中桓仁县猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性率最高，为80%，本溪，明山区分别为77%，72%。

3.3猪蓝耳病的抗原由图2可知，屠宰场的高致病性猪繁殖与呼吸综合征发生的阳性率均为0。

图2　猪蓝耳病的抗原

4　讨论

目前，猪繁殖与呼吸综合征在养殖业已得到越来越多的重视。抗体水平是反映猪群感染状态或免疫状态的重要指标，实时监测抗体水平的高低可以对于重大疫情的发生进行科学预警预报，同时还能评估免疫接种效果，并为制定科学的免疫程序和兽药的使用提供科学的依据，对于免疫工作也具有促进作用。酶联免疫吸附试验（ELISA）是目前检测PRRSV抗体较为敏感的方法之一，ELISA检测血清PRRS抗体敏感度高、特异性强，因此目前仍被许多国家和地区广泛采用。本次检测利用间接ELISA方法调查了2013年本溪地区种猪场、商品代猪场、散养户的PRRS免疫猪场的抗体水平。由测定结果可知，种猪场的免疫抗体阳性率最高，商品代和散养户虽然都明显低于种猪场，但都达到了70%以上，种猪场和商品代的阳性率高于散养户，原因是其对该病重视程度较高，能够定期进行免疫，饲养管理规范，定期消毒；散养户的免疫合格率偏低，与饲养管理水平落后、养殖环境恶劣、引种混乱、免疫程序不科学及疫苗使用不规范等不良因素的存在有很大的关系。以往用于诊断PRRS的方法有病毒分离鉴定、间接免疫荧光试验（IFA）、ELISA和RTPCR等。对隐性感染或持续带毒猪进行检测的方法必须具备高敏感性及高特异性。而传统的检测方法存在耗时长，敏感性低等缺点。曾建立了高致病性PRRSVRT-PCR鉴定技术，然而该方法的灵敏度与实时荧光定量RT-PCR技术比较有明显的差距。实时荧光定量PCR是一将常规PCR与荧光检测相结合的技术，不仅具有敏感性高、特异性强、用时短等优点，而且可以通过分析软件对数据进行分析整理，结果准确直观，十分有利于病原体的检测。本调查采用荧光定量RT-PCR方法对采集的猪组织样品进行了检测，结果为待检样品均为阴性，表明本地区发生猪蓝耳病的危险性较低。

中图分类号：S858.28

文献标识码：A

文章编号：1007-1733（2015）04-0049-02

收稿日期：（2015-01-21）