（工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

（工业发酵微生物教育部重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

采用双层平板点接法，从 140株植物乳杆菌中筛选出一株抗娄地青霉活性较高的菌株 IMAU80134，从酸粥中筛选出一株抗黄曲霉活性较高的植物乳杆菌TK9.对植物乳杆菌TK9和IMAU80134的抗真菌谱进行研究发现，两株菌除分别对黄曲霉和娄地青霉有抑制作用外，对烟曲霉、柑橘青霉、草酸青霉也有不同程度的抑菌作用，其中植物乳杆菌TK9和IMAU80134对草酸青霉有相对较强的抑制作用，抑菌圈半径分别为12.3，mm和12.7，mm.将植物乳杆菌TK9和IMAU80134应用于馒头和酸奶的防腐模拟实验，植物乳杆菌TK9可分别将馒头和酸奶的保质期延长1，d和4，d，菌株IMAU80134可分别将馒头和酸奶的保质期延长3，d和4，d.

植物乳杆菌；抗真菌；生物防腐

霉菌引起的食品腐败可以造成巨额的经济损失，霉菌产生的毒素会危及人们的健康与生命安全［1］.对于食品行业来说，食品安全与卫生问题是其发展的关键问题之一.以前，人们常用一些物理方法和添加化学防腐剂防止食品腐败变质和延长食品的货架期.但物理方法存在使用范围窄、能耗大、设备造价高等缺点而难以广泛推广；化学防腐剂又存在着安全隐患，长期食用会危害人体健康，且许多腐败菌已对化学防腐剂产生抗性.随着人们生活水平的提高，人们对食品的要求已不仅仅满足于传统意义上的色、香、味，更注重于食品的天然、安全、无残留化学制剂.而生物防腐保鲜因其天然、高效、无毒或低毒以及不破坏食品的原有风味等显著特性，目前已成为国际食品添加剂市场的新宠［2-4］.

乳酸菌作为益生菌，是公认的安全级（generally recognized as safe，GRAS）菌株.它分泌的一些代谢产物可以抑制某些细菌及真菌的生长.此外，乳酸菌还具有与霉菌毒素结合的能力，可见乳酸菌及其代谢产物在生物防腐领域具有很好的应用潜力［5］.Sathe等［6］将一定细胞浓度的植物乳杆菌和一定浓度的腐败真菌孢子悬液喷洒在黄瓜的伤口上，对照只加病原菌或只加植物乳杆菌，结果喷有植物乳杆菌的黄瓜的保质期明显延长.Lan等［7］向葡萄表面喷洒一定浓度的乳酸菌发酵液，能使表面含有草酸青霉的葡萄的保质期延长 6，d.Muhialdin等［8］从食物中筛选出 4株具有抗真菌活性的乳酸菌，实验证明所筛选出的菌株的上清液可使乳酪的保质期在4，℃时延长19～29，d，在 20～30，℃时延长 6～12，d.本实验分别以娄地青霉和黄曲霉为指示菌，筛选出两株抑菌能力较强的植物乳杆菌，并研究了这两株对其他霉菌的抑制活性和这两株菌在馒头和酸奶中的防腐效果.

1 材料与方法

1.1 菌种与供试食物

140株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）来自内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室；L.，plantarum TK9 是本实验室从内蒙古地区传统自然发酵酸粥中筛选获得.娄地青霉菌（Penicillium roqueforti）购于中国普通微生物菌种保藏中心.黄曲霉（Aspergillus flavus）由天津科技大学生化工程研究室保存.柑橘青霉（Penicillium citrinum）来自浙江大学生物技术研究所.草酸青霉（Penicillium oxalicum）从腐烂的苹果中分离获得.烟曲霉（Aspergillus fumigatus）由天津科技大学工业发酵微生物重点实验室筛选保藏.

供试食物纯牛奶和酸奶购于超市.

1.2 培养基

乳酸菌活化培养基采用 MRS培养基：蛋白胨10，g、牛肉膏10，g、酵母膏5，g、KH2PO42，g、柠檬酸三铵 2，g、乙酸钠 2，g、葡萄糖 20，g、吐温 80 1，mL、MgSO4·7H2O 0.5，g、MnSO4·4H2O 0.25，g、固体琼脂20，g、蒸馏水1，L，pH 6.5，115，℃灭菌20，min.

酸粥中乳酸菌筛选培养基：含有 1% CaCO3的MRS固体培养基.

真菌培养基采用 PDA培养基：马铃薯洗净去皮，称取200，g切成小块，加水煮烂（煮沸30，min，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，加入 20，g葡萄糖和琼脂（制备半固体培养基加入 8，g琼脂，制备固体培养基加入 20，g琼脂），继续加热揽拌混匀，稍冷却后再补足水分至 1，000，mL，分装于试管或者锥形瓶，121，℃灭菌 20，min后取出试管摆斜面或者摇勾，冷却后保存备用.

1.3 植物乳杆菌培养和指示菌霉菌孢子悬液的制备

1.3.1 菌株活化

取少量保存于体积分数为 30%甘油溶液内的植物乳杆菌于 MRS琼脂平板上划线，挑取单菌落用MRS固体斜面培养基进行菌种活化传代，从活化的MRS固体斜面培养基上挑取适量菌体接入 MRS液体培养基中，37，℃静置培养12，h.

1.3.2 植物乳杆菌发酵液的制备

从活化的种子液中按 5%接种量接种于发酵培养基内，37，℃恒温培养48，h后即得到乳酸菌发酵液. 1.3.3 指示菌霉菌孢子悬液的制备

将接种霉菌的PDA斜面培养1周，用无菌水洗下孢子，3层擦镜纸过滤除去菌丝得到孢子悬液.用血球记数板进行计数，确定孢子悬液的浓度.

1.4 抑菌活性检测方法

1.4.1 双层平板点接法

吸取乳酸菌发酵液5，µL点在MRS固体平板中央，37，℃培养 48，h后，在平板上轻轻倾倒10，mL含有霉菌孢子 104，mL-1的 PDA培养基，28，℃培养48，h，测量抑菌圈半径，每个样品重复测定3次.

1.4.2 牛津杯法

将 37，℃培养 48，h的乳酸菌发酵液 8，000，r/min离心去除菌体，上清液冷冻干燥后，悬浮在无菌水中，浓缩到原始浓度的 15倍.用含有霉菌孢子104，mL-1的 10，mL PDA倒平板，待其凝固后放上灭过菌的牛津杯，向牛津杯中加入 150，µL待测上清浓缩液.28，℃培养 48，h，测量抑菌圈半径，每个样品重复测定3次.

1.5 乳酸菌的应用实验

1.5.1 应用于馒头的防腐实验［9］

（1）酸面团发酵剂的制备：在 MRS培养基中将活化后的所筛选出的抗真菌乳酸菌菌种培养至对数后期，取菌液于8，000，r/min离心5，min得到菌泥.将菌泥（108，g-1）和酵母（1，g/100，g）接种到等比例混合的面粉和无菌水中，搅拌混匀，对照只接种酵母（1，g/100，g），放入37，℃恒温恒湿培养箱中发酵至pH为 4.0.待发酵完成后将酸面团灌入无菌培养皿中，厚度为1.0，cm，于-70，℃预冻4，h后，冷冻干燥机冻干约24，h.

（2）馒头的制作：称取面粉 45.5，g、水 40，mL、酵母0.9，g和抗真菌乳酸菌冻干发酵剂4.5，g，对照称取面粉 50，g、水 40，mL、酵母 0.9，g，和面至面团表面光滑，成形的面团于 37，℃、相对湿度 85%发酵至原来大小的 2～2.5倍取出，滚圆，蒙保鲜膜松弛 15，min左右，将松弛好的面团于蒸锅沸水蒸制30，min.

（3）防腐实验：馒头蒸好以后，放入无菌的钢桶中，冷却，于无菌超净工作台上将其切成片，并向馒头切片表面喷洒 1.5，mL娄地青霉孢子悬液（浓度为102，mL-1）.将其装到塑料袋中，密封，每隔约 2，d向里面稍微洒一次无菌水，保证其湿度，室温放置，观察霉菌开始生长的时间.

1.5.2 应用于酸奶的防腐实验

准备 100，mL纯牛奶，倒入灭菌的三角瓶内，加入 10，mL纯酸奶（只含保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌）.辅助发酵剂所筛选出的抗真菌乳酸菌添加量为5%，不加辅助发酵剂的作为空白对照，搅拌后取20，mL注入灭过菌的培养皿，于42，℃发酵约12，h.向发酵好的酸奶表面喷洒黄曲霉孢子悬液（浓度为103，mL-1），每天观察酸奶表面霉菌的生长状况.

2 结果与讨论

2.1 菌种筛选

2.1.1 抗娄地青霉乳酸菌的筛选

采用双层平板点接法来挑选对娄地青霉有抑制能力的菌株.如果在乳酸菌菌落周围有透明的抑菌圈，说明其有抗真菌能力，抑菌圈的大小在一定程度上反映抑菌能力的大小.供试的 140株植物乳杆菌中，抑菌圈半径＞9，mm有20株.将所筛选的20株植物乳杆菌用牛津杯法进行复筛，发现植物乳杆菌IMAU80134对娄地青霉的抑菌效果最好，其抑菌圈半径达到8.4，mm.图1为除IMAU80134外的另外19株菌中的3株与IMAU 80134的比较结果.

图1 部分乳酸菌对娄地青霉的抑菌活性Fig. 1 Antifungal activity of LAB strains against P. ，roqueforti

2.1.2 酸粥中抗黄曲霉乳酸菌的筛选

吸取1，mL菌液，注入9，mL生理盐水中，依次进行10倍梯度的稀释，取2个稀释梯度10-3、10-4稀释液，分别取0.1，mL涂布于MRS培养基上，37，℃培养36～48，h后，随机挑取溶钙圈大且符合乳酸菌菌落形态特征的单菌落，镜检后在 MRS 固体培养基上反复划线进行纯化，直至显微镜下的菌株形态特征一致，得到TK9、TKA2、TKA3、TKB1、TKB2、TKC1、TKC2、TKC3、TKD1、TKD2.针对这几株菌用双层平板点接法检测其抑制黄曲霉的效果，其中抑菌圈半径＞9，mm的是菌株TK9、TKC1，7～9，mm的是菌株TKA2、TKB2，1～7，mm的是菌株 TKB1、TKC3、TKA3、TKD2、TKC2、TKD1.

由此得到 2株抑菌效果较好的乳酸菌 TK9和TKC1，经 16S rDNA方法鉴定TK9也为植物乳杆菌.

2.2 植物乳杆菌IMAU80134和TK9的抑菌谱

植物乳杆菌IMAU80134和TK9对霉菌的抑制效果如图2所示.由图2可知：植物乳杆菌TK9与IMAU80134除了分别对黄曲霉和娄地青霉有抑制活性外，对所提供的其他指示菌也有抑菌活性.其中对草酸青霉的抑菌活性最好，植物乳杆菌 TK9和IMAU80134的抑菌圈半径分别为 12.3，mm 和12.7，mm；对柑橘青霉的抑菌活性最差，抑菌圈半径分别为4.6，mm和4.3，mm.同种植物乳杆菌对不同的霉菌的抑制效果不同；针对相同的指示菌时，不同的植物乳杆菌的抑制效果也不同.

图2 植物乳杆菌对霉菌的抑制效果Fig. 2 Antifungal activity of L.， plantarum against mould

2.3 乳酸菌的防腐实验结果

食物若在存储过程中感染真菌并进一步产生真菌毒素会对人类健康造成很大的危害.将乳酸菌作为防腐剂应用于食物，可以有效抑制真菌的生长并延长保质期.虽然目前已有很多关于抗真菌的乳酸菌及其抑菌物质特性的研究，但它们的抗真菌活性大多是在实验室条件下被检测出来的，如本实验的前半部分.由于环境、菌体生长基质不同等原因，若将其应用食品中不一定能够检测到抗真菌活性.如Rosenquist 等［10］通过agar spot assays筛选出的具有强抑菌活性的乳酸菌在面团中就不能表现出同样的效果.本实验以娄地青霉和黄曲霉为指示菌，检测植物乳杆菌TK9和IMAU80134是否有作为生物防腐剂的潜能.

2.3.1 应用于馒头中的生物防腐实验

娄地青霉是面包中最常见的腐败真菌，而馒头与面包的配料相似，所以以娄地青霉为指示菌，研究植物乳杆菌对自制馒头的防腐效果，结果如图 3所示.由图3可以看出：第3天对照组表面孢子开始萌发，而加入植物乳杆菌 TK9的实验组在第 4天也跟着萌发，加入植物乳杆菌IMAU80134的实验组在第6 天才开始萌发.

图3 乳酸菌作为防腐剂在馒头中的应用情况Fig. 3 Evaluation of bio-protection effects on Chinese steamed bread

近年来，有不少关于植物乳杆菌延缓面包腐败的研究，如与只接种酵母的面包相比，接种有植物乳杆菌 FST 1.7和酵母的酸面团面包，其表面腐败真菌Fusarium culmorum和Fusarium graminearum的生长速度明显变缓［11］.与普通面包相比，用 L.，plantarum CRL 778和酵母制作的酸面团面包使面包表面的黄曲霉孢子延缓了 5，d萌发［9］.本实验中的两株植物乳杆菌虽然不能让娄地青霉孢子延缓5，d萌发，但与对照相比，仍具有延长馒头保质期进而作为生物防腐剂的潜能.

2.3.2 应用于酸奶中的生物防腐实验

酸奶由于含有丰富的营养成分，极易被杂菌污染，再加上相关生产企业设备、加工环境卫生状况等问题，会导致酸奶保质期内出现变质现象，而酸奶的变质主要是由微生物引起的.由于霉菌最适生长 pH为 3.8～6.0，与酸奶的 pH 4.2～4.7 相近，所以霉菌是酸奶的主要污染物之一［12］.利用具有抗真菌活性的乳酸菌来发酵生产酸奶达到延长酸奶本身的保质期也是目前的一个研究方向.如李红娟［13］将Lactobacillus casei AST18作为辅助发酵剂添加到酸奶中，28，℃贮藏时，可将酸奶的保质期延长 4，d.本实验将植物乳杆菌TK9和IMAU80134作为辅助发酵剂应用到酸奶中，观察其抑菌状况.

乳酸菌应用于酸奶的生物防腐实验结果如图 4所示，指示菌为黄曲霉.由图4可知：第2天，空白对照表面开始出现霉菌污染情况，接有植物乳杆菌TK9和 IMAU134，酸乳表面无明显变化；直到第 6天，接有植物乳杆菌TK9和IMAU80134菌的酸乳表面才开始出现杂菌污染状况.两株植物乳杆菌之所以能抑制酸奶中黄曲霉的生长，原因可能是植物乳杆菌能产生一些具有抑菌作用的活性物质，如乳酸、醋酸、丙酸、过氧化氢、羟基脂肪酸和肽类物质等［5，14］.

图4 乳酸菌作为防腐剂在酸奶中的应用情况Fig. 4 Evaluation of bio-protection effects on yoghourt

3 结 语

本实验以娄地青霉为指示菌，从140株植物乳杆菌中筛选出一株抗娄地青霉活性较高的菌株IMAU80134；以黄曲霉为指示菌从酸粥中筛选出一株抗黄曲霉活性较高的植物乳杆菌 TK9.这两株菌除了分别对黄曲霉和娄地青霉有抑制作用外，对烟曲霉、草酸青霉和柑橘青霉也有抑菌作用.将植物乳杆菌IMAU80134和TK9应用于馒头和酸奶的模拟生物防腐实验，菌株IMAU80134可分别将馒头和酸奶的保质期延长3，d和4，d，植物乳杆菌TK9可分别将馒头和酸奶的保质期延长1，d和4，d.

［1］ Legan J D. Mould spoilage of bread：The problem and some solutions［J］. International Biodeterioration & Biodegradation，1993，32（1/2/3）：3353.

［2］ 王林，胡云，胡秋辉. 食品的微生物保鲜技术［J］. 食品科学，2005，26（2）：242-244.

［3］ 熊涛，乐易林. 生物保鲜技术的研究进展［J］. 食品与发酵工业，2004，30（2）：111-114.

［4］ 程璐，缪铭，张涛，等. 食品生物防腐剂：抗真菌乳酸菌研究进展［J］. 食品与发酵工业，2010，36（9）：129-133.

［5］ Dalié D K D，Deschamps A M，Richard-Forget F. Lactic acid bacteria-Potential for control of mould growth and mycotoxins：A review［J］. Food Control，2010，21（4）：370-380.

［6］ Sathe S J，Nawani N N，Dhakephalkar P K，et al. Antifungal lactic acid bacteria with potential to prolong shelf-life of fresh vegetables［J］. Journal of Applied Microbiology，2007，103（6）：2622-2628.

［7］ Lan W，Chen Y，Wu H，et al. Bio-protective potential of lactic acid bacteria isolated from fermented wax gourd［J］. Folia Microbiologica，2012，57（2）：99-105.

［8］ Muhialdin B J，Hassan Z，Sadon S K. Antifungal Activity of Lactobacillus fermentum Te007，Pediococcus pentosaceus Te010，Lactobacillus pentosus G004，and L. paracasi D5 on Selected Foods［J］. Journal of Food Science，2011，76（7）：M493-M499.

［9］ Gerez C L，Torino M，Rollán G，et al. Prevention of bread mould spoilage by using lactic acid bacteria with antifungal properties［J］. Food Control，2009，20（2）：144-148.

［10］ Rosenquist H，Hansen Å. The antimicrobial effect of organic acids，sour dough and nisin against Bacillus subtilis and B. licheniformis isolated from wheat bread［J］. Journal of Applied Microbiology，1998，85（3）：621-631.

［11］ Moore M M，Dal Bello F，Arendt E K. Sourdough fermented by Lactobacillus plantarum FST 1.7 improves the quality and shelf life of gluten-free bread［J］. European Food Research and Technology，2008，226（6）：1309-1316.

［12］ 黄永红，尤宏，王锡波. 酸奶变质的污染菌群分析［J］.中国乳业，2002（2）：21.

［13］ 李红娟. 抗真菌乳酸菌的筛选及特性研究［D］. 北京：中国农业科学院，2011.

［14］ Gaggia F，Di Gioia D，Baffoni L，et al. The role of protective and probiotic cultures in food and feed and their impact in food safety［J］. Trends in Food Science & Technology，2011，22（s1）：58-66.

抗真菌乳酸菌的筛选及其对馒头和酸奶的防腐实验

王应东，陈 冲，王海宽

Screening of Antifungal Lactic Acid Bacteria and its Application in Chinese Steamed Bread and Yogurt

WANG Yingdong，CHEN Chong，WANG Haikuan
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

With the overlay method，the strain IMAU80134 with a high antifungal activity against Penicillium roqueforti was screened from 140 Lactobacillus plantarum . Lactobacillus plantarum TK9 isolated from acid gruel displayed a high antifungal activity against Aspergillus flavus. The broad spectrum of antifungal activity of the 2 colonies indicated that both L. plantarum TK9 and IMAU80134 could inhibit Penicillium citrinum，Penicillium oxalicum and Aspergillus fumigatus，in addition to A. flavus and P. roqueforti. L. plantarum TK9 and IMAU80134 had stronger antifungal activity against P. oxalicum，The inhibition zone radii were 12.3 mm and 12.7 mm respectively. Meanwhile，both L. plantarum TK9 and IMAU80134 were applied to the bio-preservation of Chinese steamed bread and yoghurt in vitro simulation experiments.Their shelf-life could be extended 1 and 4 days respectively by L. plantarum TK9，3 and 4 days respectively by L. plantarum IMAU80134.

Lactobacillus plantarum；antifungal activity；bio-preservation

Q93 文献标志码：A 文章编号：1672-6510（2015）02-0011-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20140058

2014-04-15；

2014-07-12

国家自然科学基金资助项目（30900961）；乳品生物技术与工程教育部重点实验室开放课题基金资助项目

王应东（1989—），男，陕西人，硕士研究生；通信作者：王海宽，教授，hkwang@aliyun.com.

周建军