陈 华 吕妍琨 齐 鹏 杜荣品 谷 剑 陈淑霞 耿彦平 李 燕 于 芳

(河北省人民医院心脏中心，河北 石家庄 050051)

急性心肌梗死患者多因冠状脉粥样硬化起病，而后因过劳、激动、暴饮暴食、便秘、寒热刺激、吸烟、酗酒等导致斑块破裂，进而阻塞冠状动脉管腔，诱发心肌缺血、缺氧性坏死〔1〕。心肌梗死患者临床症状有出汗、烦躁、恶心、呕吐、心绞痛、休克、心力衰竭等。研究显示，心肌缺血、缺氧性坏死是一个多种细胞因子、多途径共同作用的结果〔2〕。Rho激酶是胶原交联羧基末端肽(CTP)结合蛋白的重要效应分子，可通过Rho激酶信号通路参与多种细胞的生理功能。本文拟分析Rho激酶信号通路在心肌梗死模型大鼠心肌细胞凋亡组织中的表达变化及对心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只健康雄性Wistar大鼠，体质量245～285 g，平均(262.8±18.5)g，均购买自某大学动物实验中心(动物许可证编号:SCX20040018);随机选取15只作为假手术组，其余35只进行心肌梗死造模成功后随机分为治疗组和模型组各15只(造模中死亡2只，剩余3只弃用)。均自由进食进水，光照时间12 h，室温23～25℃，平均湿度(55±5)%的环境中。

1.2 实验仪器与药品 选用杭州博日生物工程有限公司生产的RNA抽提试剂盒、T-PCR试剂盒;选用天津红同药业股份有限公司生产的法舒地尔;选用武汉博士德生物工程有限公司生产的ABC免疫组化试剂盒、抗Bax及抗Bcl-2抗体。选用成都泰盟科技有限公司生产的L-420E+生物机能实验系统;选用M3 Reserch Inc PUC-IOOUM PCR扩增仪;选用上海医用恒温设备厂生产的FX-DY-252型电泳仪、电热恒温水槽。

1.3 造模及治疗方法 腹腔水合氯醛麻醉大鼠，固定于手术台，去除胸部、颈部毛发，消毒，切开颈部皮肤，暴露气管及甲状腺，于甲状腺后方钝性分离气管，需注意不损伤甲状腺及血管。剪开气管环，行气管插管操作，连接呼吸机。剪开胸部皮肤，暴露肌肉组织，分离胸大肌、前锯肌，显露肋骨，打开胸膜，进入胸腔，探查大鼠左心耳位置，于左心耳下方2 cm处进针，缝扎左心耳及肺动脉圆锥交接处及静脉。观察心电图，如ST段抬高，同时结扎线下心肌颜色变淡，即表明造模成功。逐步缝合胸腔及颈部切口，常规抗感染治疗，放回饲养笼。治疗组大鼠行5 mg/kg胸腔法舒地尔给药，2次/d，持续4 w。另两组等量生理盐水处理。

1.4 心肌梗死面积测定 4 w后腹腔麻醉大鼠，切开大鼠颈部皮肤，暴露右侧颈动脉。游离大鼠右侧颈动脉，结扎远心端，动脉夹夹闭近心端，留置静脉管，连接血压换能器，检测大鼠左心室收缩压(LVSP)、左室舒张压(LVEDP)、左室内压最大上升和下降速率(+dp/dtmax、-dp/dtmax)。

1.5 指标检测方法 心肌梗死面积测定后处死大鼠，取出心脏，用生理盐水漂洗，剪出梗死周边区心肌组织，将其中一部分组织甲醛固定，另一部分存储于－70℃温箱内待用。根据RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA，使用RT反应试剂盒进行cDNA转录操作，PCR扩增，引物序列由上海生工生物工程股份有限公司提供，电泳扩增产物，选用经凝胶成像系统分析样本Rho激酶mRNA、Bax蛋白及Bcl-2蛋白表达情况。

1.6 观察指标 观察4 w后的血流动力学指标:LVSP、LVEDP、+dp/dtmax，-dp/dtmax;模型组和治疗组心肌缺血面积、心梗面积测定值;3组心肌组织中Rho激酶mRNA、Bax及Bcl-2蛋白的表达情况。

1.7 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验，计量资料采用t检验。

2 结果

2.1 3组血流动力学指标差异 模型组LVSP、+dp/dtmax、－dp/dtmax显著低于治疗组和假手术组(P＜0.05)，LVEDP显著高于治疗组和假手术组(P＜0.05)，治疗组LVSP、+dp/dtmax、－dp/dtmax显著低于假手术组(P＜0.05)，LVEDP显著高于假手术组(P＜0.05)。见表1。

表1 3组血流动力学指标比较(±s，kPa，n=15)

表1 3组血流动力学指标比较(±s，kPa，n=15)

与假手术组比较:1)P＜0.05;与治疗组比较:2)P＜0.05;下表同

LVSP LVEDP +dp/dtmax -dp/dtmax假手术组 20.6±0.62 －1.26±0.32 1 102.5±230.6 －1 098.6±组别218.9模型组 15.3±0.591)2)0.36±0.611)2)683.9±172.51)2)－681.5±162.41)2)治疗组 16.8±0.721) －0.64±0.421)883.5±135.41)－856.2±141.51)F值 28.253 13.698 8.624 7.182 P值 ＜0.001 0.002 0.026 0.032

2.2 治疗组和模型组心肌缺血面积、心肌梗死面积百分比值治疗组心肌缺血面积〔(33.6±2.8)%〕低于模型组〔(35.5±3.2)%〕，但差异不显著(t=1.731，P=0.082);治疗组心梗面积〔(29.3±2.7)%〕显著低于模型组〔(32.6±2.9)%〕(t=3.226，P=0.004)。

2.3 3组心肌的Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表达差异 3组Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表达差异有统计学意义(P＜0.05);组间均具有显著差异(P＜0.05)。见表2。

表2 3组心肌组织Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表达差异(±s，n=15)

表2 3组心肌组织Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白表达差异(±s，n=15)

蛋白假手术组组别 Rho激酶mRNA Bax蛋白 Bcl-2 0.41±0.06 0.38±0.29 1.26±0.43治疗组 0.28±0.061)2) 0.72±0.251)2) 1.74±0.411)2)模型组 0.48±0.041) 1.08±0.321) 0.63±0.381)F/P值10.742/0.002 8.288/0.026 9.690/0.018

3 讨论

急性心肌梗死发病后患者将出现大规模的心肌细胞坏死情况，此时患者心肌功能将大幅下降，梗死及周围心肌收缩乏力，心肌总收缩力降低，+dp/dtmax，-dp/dtmax下降，LVSP下降，心肌泵血能力也随之降低，最终导致每搏输出量减少，心室射血后余量降格，诱使LVEDP升高〔3〕。为保证心脏正常工作，未梗死区域心肌组织需对梗死区域进行代偿收缩，并出现心肌肥大、心室重构情况。心室重构是急性心肌梗死发病后的一种代偿反应，当代偿超过一定程度时，患者将合并心功能不全症状，最终发展为心力衰竭，危及生命〔4〕。本研究提示急性心肌梗死大鼠心脏收缩、舒张能力严重损伤，而有效的治疗介入可改善大鼠心脏功能。

心肌细胞凋亡是Rho激酶、Bax蛋白等多种细胞因子共同作用结果。Rho激酶是丝氨酸/氨酸蛋白激酶，分子量为160 kD〔5〕。Rho激酶C末端区域具有激酶负性调控作用，静息状态下，Rho激酶C末端可通过折返或催化来抑制Rho蛋白结合结构域(RBD)、ATP活性，并诱使下游信号无法与底物相互结合。Rho激酶具有介导黏着斑、整合素活性，并参与细胞生存的功能，抑制Rho激酶可损伤细胞骨架内的肌动蛋白丝的完整性进而诱发细胞凋亡〔6〕。Rho激酶还可抑制Bcl-2活性，降低炎症反应，进而降低细胞凋亡率，这表明Rho激酶可通过降低Bcl-2活性来参与细胞凋亡过程，是心血管疾病发生、发展的重要参与因子。B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)是原癌基因的一种，其可抵抗多种细胞毒素作用，增强DNA损伤因子的抵抗性，最终抑制细胞凋亡〔7〕。Bax基因是Bcl-2基因家族的一员，广泛存在于肝、肾、呼吸系统及血管平滑肌细胞内，可与Bcl-2组成异二聚体，并抑制Bcl-2活性〔8〕。Bax蛋白是生物体重要的促细胞凋亡因子，已有研究显示，创伤失血性大鼠存在明显Bax蛋白高表达情况。Bax/Bcl-2蛋白比例是细胞凋亡抑制作用强弱的重要影响因子〔9〕。本研究提示法舒地尔具有抑制Rho激酶活性，调节Bcl-2蛋白表达，抑制细胞凋亡的作用。法舒地尔是一种具有广泛药理作用的新型药剂，可通过ATP竞争Rho激酶催化区的ATP位点，进而抑制Rho激酶mRNA的自表达〔10〕。

综上，Rho激酶mRNA、Bax蛋白、Bcl-2蛋白是心肌细胞凋亡的重要参与因子，其中Rho激酶mRNA、Bax蛋白具有促细胞凋亡作用，而Bcl-2蛋白具有抑制细胞凋亡的作用。而法舒地尔用药后大鼠Rho激酶mRNA表达显著降低，进而降低心肌细胞凋亡率，减轻心肌梗死面积。

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3 谭力力，李 潞，刘丽敏，等.肾素血管紧张素醛固酮系统拮抗剂对自发性高血压大鼠心肌缝隙连接蛋白Cx43表达的影响〔J〕.四川大学学报(医学版)，2013;44(4):531-5，549.

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10 马东蔚，王秋月，马小羽，等.法舒地尔通过Rho/ROCK信号通路对高糖培养人肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化的影响〔J〕.中华内科杂志，2011;50(7):580-4.