乔友军 汪 欣 高 杰 王 宝 贾春祎 (吉林大学第一医院，吉林 长春 3006)

白细胞介素(IL)-18是一种新型具有多态性的免疫细胞调节因子，以前称干扰素(IFN)-γ诱导因子〔1〕。IL-18具有抗多种病毒、抗细菌、真菌的功能〔2〕;其对T细胞、B细胞免疫及NK细胞免疫均有相应的生物学作用。IL-18可直接诱导NK细胞和单核细胞分泌 IFN-γ〔3〕，IFN-γ 不抑制 B 细胞的分泌，但可抑制B细胞生成IgE、IgG，对IgG2d高表达〔4〕。IL-18通过增进分泌IL-10，使肿瘤细胞对NK细胞的敏感性增加〔5〕，从而增强对肿瘤细胞的杀伤力。当NK细胞与肿瘤靶细胞结合后开始相互作用，随即启动细胞死亡信号，最终细胞DNA的断裂致使细胞凋亡，起到抗肿瘤的作用。

1 资料与方法

1.1 主要试剂仪器 DNA MARKER:宝生物工程(大连)有限公司;质粒DNA提取试剂盒:天根生化科技有限公司;隔水式恒温培养箱:GSP-9270型，上海博迅实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 含有pGEX-IL-18重组体质粒的E.coli JM109菌复苏－80℃冰箱取E.coli JM109菌冻存管1支，立即放入37℃水浴箱中，待完全融化后在生物安全柜内以无菌程序将JM109菌液接种于50 ml LB液体培养基中，37℃，230 r/min振荡培养18 h，观察菌液生长情况，供质粒提取使用。

1.2.2 质粒提取 柱平衡后，集菌5 ml，12 000 r/min离心1 min，吸弃上清液。向离心管中加入P1 250 μl，用涡旋振荡器彻底使细菌沉淀悬浮。向离心管中加入P2 250 μl，颠倒混匀6次。向离心管中加入 P3 350 μl后，颠倒混匀 6次，再12 000 r/min离心10 min后会有沉淀形成。收集上清转移到吸附柱CP3中，12 000 r/min离心40 s，倒掉废液。向吸附柱CP3中加入漂洗液PW 600 μl，再12 000 r/min离心40 s，倒掉废液。先将吸附柱CP3放入收集管中，再12 000 r/min离心2 min。向吸附膜的中间滴加洗脱缓冲液EB 60 μl，室温放置2 min，12 000 r/min离心2 min，将质粒溶液收集到离心管中备用。该质粒为pGEX-IL-18，并经过测序和基因库比对证实。

1.2.3 1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒 配制1%琼脂糖凝胶后，放入电泳槽中。将样品与6×DNA上样缓冲液混合，并将样品混合液反复吹打混和均匀，加入到凝胶的加样孔内，再加入 DNA Marker 2 μl。电泳仪开启，电压 100 V，电流90 mA，时间为30 min，最后进行琼脂糖凝胶电泳。用凝胶成像仪观察照相。

1.2.4 转化 将质粒转化到DH5α细菌内，制备表达IL-18的细胞。组质粒 pGEX-IL-18具备表达 IL-18的功能，转化到DH5α细菌内，进行增菌培养，即可得到表达的IL-18。

1.2.4.1 受体菌的培养 将甘油贮存的受体菌DH5α在LB平板上划线，37℃培养20 h。挑取2 mm大小的单菌落接种于1 ml LB液体培养基中，37℃振摇过夜。取上述菌液200 μl转入50 ml LB液体培养基中，37℃ 300 r/min，振荡培养2.5 h，使细胞的浓度达5×107个/ml，此时细菌的OD260一般在0.2～0.4之间。

1.2.4.2 感受态细胞的制备 将培养的菌液冰上放置10 min，然后转移离心管中，4℃ 4 000 r/min离心10 min，弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，使剩余的液体流尽。加入10 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2使沉淀轻轻悬浮，然后冰浴15 min。此时为感受态细胞。将上述菌液4℃ 4 000 r/min离心10 min，弃上清，每50 ml的原培养物加入2 ml冰预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，再加终浓度为10%的灭菌甘油，按每份200 μl分装在Ep管中，置－70℃冻贮。

1.2.4.3 质粒转化到宿主菌细胞内 把感受态细胞各200 μl分别加入实验管、阳性管、阴性管中;连接产物(100～500)加入实验管10 μl;已知质粒DNA(10)加入阳性管10 μl;无菌水加入阴性管10 μl后42℃ 90 s后迅速置冰浴3～5 min;再分别在实验管、阳性管、阴性管中加入SOC培养基各800 μl;37℃振摇培养45～90 min。

1.2.4.4 蓝白筛选阳性重组体 取含100 μg/ml氨苄青霉素的LB平板，在板面上涂布IPTG试剂和X-gal试剂。将200 μl上述培养物，以玻璃涂布棒轻轻地平铺于琼脂平板表面。将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，37℃过夜培养。观察蓝白菌落，白色为阳性重组体。

2 结果

质粒提取琼脂糖凝胶检测结果质粒大小为2.7 kb，见图1。测序结果为IL-18基因片段，见图2。重组体插入基因片段生物信息比对显示，插入片段长度和顺序与目的基因相符，见图3。蓝白筛选与抗性筛选一同使用，筛选结果:未转化的菌不具有抗性，不生长;转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落;转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。

图1 pGEX-IL-18重组体质粒电泳结果

图2 IL-18基因片段测序结果

图3 重组体插入基因片段生物信息比对截图

3 讨论

IL-18是肿瘤免疫学研究的热点。随着研究的深入，发现它实为免疫调节因子可杀伤或抑制肿瘤生长并在肿瘤免疫方面发挥了极其重要的作用。很多学者发现肿瘤患者IL-18水平在有转移患者比无转移患者和对照组有显著性增高，从而说明IL-18水平的变化可能反映了人体对肿瘤细胞的防御程度。IL-18对免疫细胞有多项免疫调节功能，这个细胞因子极大潜在的抗肿瘤能力。因此IL-18在肿瘤基因治疗方面具有潜在的发展空间，其在基础领域和应用领域都有了崭新的发展。如何利用基因工程表达来制备IL-18将是未来的趋势。

本研究探讨了基因工程制备IL-18的实验条件，为制备IL-18提供实验保障。下一步工作将是制备纯化IL-18的实验研究，将这个质粒重组体转移到具有高效表达功能的DH5α宿主菌中进行目的蛋白表达实验研究，同时探讨可通过GST标签亲和层析纯化目的蛋白的条件。基于IL-18具有重要抗肿瘤等多种的生物学功能，将对IL-18进行后续的科研工作系统研究。

1 Nakamura K，Okamura H，Nagata K，et al.Purification of a factor which provides a costimulatory signal for gamma int erferon production〔J〕.Infect Immun，1993;61(1):64.

2 Zhang T，Kawakami K，Qureshi MH，et al.Inteleukin-12(IL-12)and IL-18 synergistrically induce the fungicidal activity of murine peritoneal exudate cells against cryptococcus neoformans through production of gamma interferon by natural killer cells〔J〕.Infect Immunol，1997;65(9):3594-9.

3 Greene CM，Meachery G，Taggart C，et al.Role of IL-18 in CD4 T lymphocyte activation in Sarcoidosis〔J〕.J Immunol，2000;165(8):4718-24.

4 Born TL，Morrison LA，Esteban DJ，et al.A poxvirus protein that binds toand inactivates IL-18 and inhibit s NK cell response〔J〕.J Immunol，2000;164(6):3246-54.

5 Cardon GE，Lindemann MJ，Baiocchi R，et al.The functional characterization of interlukin-10 receptor expression on human natural killer cells〔J〕.Blood，1995;8512:3577-85.