张寒梦 刘雨佳 石丽君(北京体育大学，北京 100084)

大电导钙激活钾通道(BKCa)是血管平滑肌细胞上广泛分布的一类K+通道，在血管张力的调节中发挥着重要的负反馈调控作用〔1，2〕。自发瞬时外向流(STOCs)反馈性抑制VGCC，降低〔Ca2+〕i，对抗平滑肌的收缩，促使平滑肌舒张〔3〕。衰老会导致血管中间层弹性物质的丢失，可诱导机体动脉结构和功能发生重构〔4〕，其中血管离子通道的表达和功能亦发生改变〔5〕。衰老可引起某些血管床BKCa通道的表达和功能下调〔6〕，使动脉的舒张能力减弱，外周阻力增高，从而血压升高。与衰老相反，有氧运动对血压的稳定及血管功能的改善是有益的〔7，8〕。在青年大鼠肠系膜动脉上，有氧运动可以通过上调BKCaβ1亚基的功能使通道活性增加，从而诱发血管舒张能力增强〔9〕。但是衰老肠系膜动脉上STOCs有何变化特征以及有氧运动对其有怎样的调控作用，至今尚未见文献报道。本研究探讨有氧运动对衰老大鼠肠系膜阻力动脉平滑肌细胞STOCs的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 2月龄健康雄性Wistar大鼠购自北京维通利华实验技术有限公司，饲养至19～21月龄(老年组)，随机分为安静组(O-SED，n=6)和有氧运动组(O-EX，n=6)。另选取2月龄雄性Wistar大鼠作为青年对照组(n=6)。按照国家标准啮齿类动物饲料喂养大鼠，自由饮食，温度维持在22℃～24℃，相对湿度40%～60%，昼夜节律人工控制光照(光照时间为6:00～18:00)。

1.2 训练方案 O-EX组大鼠先进行1 w适应性跑台训练，之后进行 12 w 跑台运动，坡度 0°，15 m/min，60 min/d，5 d/w。OSED组与Young组不运动。三组均于13 w结束后的24～48 h内取材。

1.3 主要试剂及药品 牛血清蛋白(BSA)、I型胶原酶(type IS collagenase)、木瓜蛋白酶(papain)、F型胶原酶(type F collagenase)、二硫苏糖醇(DTT)、乙二胺四乙酸(EDTA)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、Iberiotoxin(IbTX)、兰诺定(Ryanodine)均购自美国Sigma公司，其余为国产分析纯试剂。Anti-KCa1.1(BKCa)和Anti-sloβ1(KCNMB1)购自以色列alomone公司。

1.4 大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞分离 具体方法参见文献〔9〕。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50 mg/kg)，麻醉后迅速取出肠系膜动脉置于4℃无钙分离液(PSS)Ⅰ中，小心剥离干净肠系膜动脉上周围脂肪组织，并将其剪成0.5～1 mm的小段。将组织转移入酶Ⅰ(mg/ml):0.3 papain、1 DTT 和 1 BSA，37℃温育25 min;之后去除酶Ⅰ，加入酶Ⅱ:1.5F型胶原酶、1Ⅰ型腹原酶和1 BSA，消化10 min。消化完毕后，组织用PSSⅡ洗3～4遍，钝头吸管轻轻吹打，制备细胞悬液，4℃保存备用。分离平滑肌细胞缓冲液 PSSⅠ(mmol/L):137 NaCl，5.6 KCl，1.0 MgCl2，10.0 G-Glucose，10.0 HEPES，0.03 硝普纳(NaOH 调节pH 至 7.4)。PSSⅡ(mmol/L):137 NaCl，5.6 KCl，1 MgCl2，10 HEPES，10 Glucose，0.42 Na2HPO4，0.44 NaH2PO4(NaOH 调节pH 至 7.3～7.4)。

1.5 电生理实验 采用两性霉素B穿孔全细胞膜片钳技术记录STOCs，终浓度为250 μg/ml。玻璃微管电极采用微管电极拉制仪(PC-10，Narishige，Japan)进行两步拉制，毛细玻璃管购自美 国 Sutter instrument(BF150-86-10，I.D 1.5 mm，O.D 0.86 mm，fire polished)，拉制后电极尖端直径约为 1～2 μm，充灌电极液后电极阻抗为4～5 MΩ。电极内液成分(mmol/L):110 冬氨酸钾(K-Asp)，30 KCl，1 EGTA，3 Na2ATP，0.85 CaCl2，10 Glucose，10 HEPES(KOH调节 pH 至 7.2);浴液成分(mmol/L):134 NaCl，10 HEPES，1 MgCl2，6 KCl，10 Glucose，1.8 CaCl2(NaOH调节pH至7.4)。电流信号经膜片钳放大器(Axon 700B amplifier)放大，采样频率10 kHz，八极Bessel低通滤波频率为2 kHz，在Clampex 10.0软件控制下，进行A/D、D/A转换。采用 Mini Analysis 6.0 program(Synaptosoft，Inc.，Decatur，GA，USA)对STOCs进行分析，STOCs阈值设为10 pA。所有实验记录都在室温(22℃～25℃)下进行。

1.6 蛋白免疫印迹分析各组肠系膜动脉BKCa通道α和β1亚基蛋白表达情况 称取100 mg肠系膜动脉组织，迅速加入500 μlRIPA裂解液，用匀浆器在冰水浴中匀浆10次，每次4～5 s，间隔4～5 s。将匀浆液于4℃以13 000 r/min离心30 min，取上清液待测。按照常规操作进行蛋白浓度的测定、电泳样品制备、聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳(上样量每孔40 μg蛋白)、转膜(BKCaα 亚基300 mA 恒流1.5 h;BKCaβ1 亚基250 mA恒流50 min)、5%BSA封闭2 h。加入用0.01 mol/L Tris盐酸缓冲液(TBST)稀释的一抗〔Anti-KCa1.1(BKCa)，1∶300;Antisloβ1(KCNMB1)，1∶200;β-actin(R-22):sc-130657，1∶300〕，室温脱色摇床上摇动孵育1 h，4℃孵育过夜;0.01 mol/L TBST漂洗三次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG〔1∶16 000(BKCaα 亚基);1∶2 000(BKCaβ1 亚基);1∶4 000(β-actin)〕孵育1 h。免疫蛋白活性由增强化学发光法检测，并采用Quantity One软件进行半定量分析。

1.7 统计学方法 应用SPSS17.0软件进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 STOCs的电压依赖性及药理学鉴定 钳制电位(HP)为－50 mV，给予阶跃电压，即去极化步阶10 mV，持续400 ms，递增至80 mV，可记录到全细胞的外向钾电流。可见STOCs随机性地叠加在全细胞电流上，随着细胞膜去极化程度的增加，叠加在曲线上的STOCs幅度逐渐增加，但具有随机性和不确定性。见图1。如改变HP，分别钳制在－40～0 mV，亦可记录到STOCs(图2A，2C，2D)。当 HP= －40 mV 时，STOCs出现的频率和幅度均较低;当HP增加到－30 mV以上时，即可观察到明显的STOCs。STOCs的幅值随着细胞膜去极化程度的增加呈现出显著增加，表现为明显的电压依赖性特征。对比－40 mV，STOCs频率亦显著增加，但 －30 mV、－20 mV、－10 mV、0 mV之间无显著差异。选用兰诺定受体阻断剂(RYR，50 μmol/L)或BKCa通道的特异性阻断剂(IbTX，100 nmol/L)分别孵育细胞2 min，可见STOCs活性显著被抑制(图2B)，提示STOCs为兰诺定受体和BKCa通道介导。

图1 穿孔膜片钳记录2月龄青年大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞的STOCs(阶跃电压模式)

图2 青年大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞STOCs电压依赖性和药理学鉴定

2.2 有氧运动对衰老肠系膜动脉平滑肌细胞STOCs的影响 在相同HP下，STOCs的幅值和频率均为Young组最大，其次为O-EX组，而O-SED组最低。如图3所示，当HP=－30 mV时，STOCs的幅值分别为(32.6±2.4)pA(Young)组、(11.4±0.7)pA(O-SED)组和(20.2±2.8)pA(O-EX)组;而频率分别为(4.50±0.40)Hz(Young)组、(1.40±0.20)Hz(O-SED)组和(2.50±0.40)Hz(O-EX)组。与 Young组比较，老年组(OSED和O-EX)STOCs的幅值和频率均显著下降(P＜0.01);而进行有氧运动训练的老年组(O-EX)又显著高于安静组(OSED，P＜0.01)，提示有氧运动显著抑制了衰老诱发的STOCs活性减弱。

图3 有氧运动对衰老大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞STOCs的影响

2.3 有氧运动对衰老肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道α和β1亚基表达的影响 分别采用BKCa通道α和β1亚基的特异性抗体〔Anti-KCa1.1(BKCa)和 Anti-sloβ1(KCNMB1)〕，可以检测到125 kD(α亚基)和28 kD(β1亚基)的蛋白表达。与Young组相比，O-SED组和O-EX组α和β1亚基表达均显著下降(P＜0.01);然而O-EX组却显著高于 O-SED组(P＜0.01)。α亚基蛋白表达:Young组(1.00±0.00)＞ O-EX组(0.72±0.17)＞O-SED组(0.65±0.11)。β1亚基蛋白表达亦呈此变化趋势，Young组(1.00±0.00)＞ O-EX 组(0.65±0.05)＞O-SED 组(0.29±0.07)。见图4。

图4 有氧运动对衰老大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa通道α亚基和β1亚基表达的影响

3 讨论

有氧运动的降压效应已得到国内外专家普遍的肯定〔10〕，运动控制血压的机制很多，其中运动对动脉平滑肌钾离子通道的调控作用日益受到关注。本研究发现:(1)衰老使STOCs活性下降，表现为相同钳制电位下STOCs的幅值和频率均显著降低;(2)蛋白免疫印迹分析显示衰老细胞BKCa的α和β1亚基表达均下降;(3)有氧运动显著抑制了上述衰老诱发的变化。此结果提示，衰老可以通过BKCa亚基分子表达下调的方式降低BKCa功能，并减弱内质网 RyRs和 BKCa之间的功能耦联，使STOCs活性减弱，从而诱导膜去极化、血管外周阻力增加;而长期规律性有氧运动能显著逆转这些变化，这可能是运动改善衰老血管功能、缓解血管张力和降低血压的重要机制之一。

在BKCa通道的研究过程中，常规全细胞模式会导致细胞内容物丢失、巨阻封接细胞脱落、细胞碎片堵住破口处造成记录电流衰减假象等问题〔11〕。而且，由于细胞内钙缓冲能力的变化，此模式很难记录到STOCs〔12〕。因此常规全细胞膜片钳记录法在某些特定研究中受到限制。本实验采用的是穿孔膜片钳法，利用两性霉素B在磷脂双分子层中形成孔道，小孔的大小只允许一价离子通过，其优点主要有:(1)大分子和高价离子不通透，避免胞内重要物质渗析，因此对离子通道起调控作用的物质浓度不受影响，电流衰减现象减慢;(2)高阻封接很稳固，可长时间持续记录;(3)电极串联电阻并未升高且相当稳定，补偿后准确性很好，减少了补偿不准确带来的误差。本实验选用穿孔膜片钳模式，于急性分离的大鼠肠系膜平滑肌细胞上成功地记录到了STOCs，记录可持续1～2 h。

本实验中记录到的STOCs具有随机性，幅值随着细胞膜的去极化程度而呈上升趋势，表现为明显的电压依赖性。如上所述，STOCs使细胞膜首先复极化、超极化，随后反馈性抑制VGCC，使其关闭，钙内流减少，从而使胞内Ca2+浓度下降，血管舒张，完成对血管收缩的负反馈调节。因此，STOCs与RyRs以及BKCa的表达和功能有直接的关系。许多血管活性物质都是通过对钙火花幅值和频率的调控以及对RyRs与BKCa通道的耦联来实现对血管张力的调节的〔13〕。Ryanodine是RyRs的特异性阻断剂，它能够以极高的亲和力与RyRs迅速结合，完全阻断RyRs的活动。而IbTX作为BKCa通道的特异性阻断剂，可用于鉴别BKCa电流。本实验结果说明STOCs确为RyRs和BKCa所介导。

本实验还发现，有氧运动显著逆转了衰老诱发的STOCs活性减弱。由于STOCs是钙火花诱发的临近细胞膜上BKCa通道的开放，因此该通道在细胞膜上的表达密度将显著影响STOCs的幅值。现已明确，血管平滑肌细胞BKCa由α和β1亚基组成，自发性高血压大鼠的BKCa通道活性增强并伴有α亚基的表达增加〔13〕。另有研究证实β1亚基的下调或减少均可使BKCa通道功能下降〔14〕。Nishimaru等〔15〕检测了幼龄和老龄 F344大鼠冠状动脉的BKCa的亚基组成，发现增龄可导致α亚基和β1亚基蛋白表达和功能下降;但Nishimaru等〔16〕研究表明在衰老大鼠脑动脉BKCa表达并未发生变化，提示增龄所致的BKCa通道结构和功能变化有组织特异性。本研究结果提示，规律性有氧运动训练可以显著抑制BKCa通道组成亚基的蛋白表达下降，这可能是各组STOCs差异的重要原因。

综上所述，衰老可诱发大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BKCa的α和β1亚基下调，从而使STOCs减弱、膜去极化和外周阻力增加;而规律性有氧运动可显著抑制此变化，这可能是运动诱导衰老血管逆重构、缓解血管张力增高的重要机制。

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