何 珊 黄劲松 沈 燕 何平红 杨 霞 达静静 易 韦 查 艳

(贵州省人民医院肾内科，贵州 贵阳 550002)

肾小管-间质损伤是导致肾小管间质纤维化发生、发展的重要过程，其病变程度与肾功能损害程度呈正相关。阻止或减慢肾小管间质纤维化的进展，可以预防慢性肾衰竭的发生〔1，2〕。维生素D，尤其是活性代谢产物1，25-二羟维生素 D3〔1，25-(OH)2-VitD3〕或骨化三醇在调节各种生物过程如钙稳态、免疫调节、细胞增殖和分化中发挥至关重要的作用〔3〕。但是，骨化三醇对进展性肾炎肾小管间质损伤的保护作用尚不完全清楚。本研究旨探讨活性维生素D3对进展性肾炎大鼠模型中肾间质纤维化基因结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响，并观察肾脏组织病理形态学改变，深入了解活性维生素D3对进展性肾炎大鼠肾间质纤维化的可能作用途径及影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料 活性维生素D3购自美国Sigma公司，IgG(OX-7)鼠抗人Thy1.1单克隆抗体购于美国Neo Markers公司，兔抗鼠低氧诱导因子(HIF)1-α多克隆购于加拿大 Assay Designs Stressgen公司，大鼠CTGF mRNA原位杂交试剂盒购于武汉BOSTER生物工程有限公司。

1.2 仪器 全自动多功能生化分析仪(日本Hitachi公司);光学显微镜(日本Olympus公司);显微图像分析系统(Olympus C3040-ADU)。

1.3 动物模型制备及分组 雄性SD大鼠(重庆腾鑫生物技术公司提供，二级)21只，体重(131.2±10)g。按数字随机表法分为假手术组(对照组，只做肾包膜剥离，不予肾脏切除)、进展性肾炎组(模型组)、活性维生素D3干预组(治疗组)，每组7只。进展性肾炎模型制备参照文献〔4〕，行右肾摘除术，分别于术后第1、2周予尾静脉注射IgG(OX-7)鼠抗人Thy1.1单克隆抗体1.2 mg/kg，共2次。活性维生素D3干预组于术后予活性维生素D3 6 ng·100 g－1·d－1加入饮水中灌胃至8 w。所有大鼠均于8 w后处死，收集24 h尿液，取大鼠心脏血并制作肾组织标本。

1.4 观察指标与检测方法

1.4.1 24 h尿蛋白定量 处死大鼠前3 d，将大鼠放入代谢笼中收集24 h尿液，每只收集3次，用双缩脲法测定尿蛋白含量。

1.4.2 血生化检测 取大鼠心脏血，测定血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、钙(Ca)、磷(P)等水平。

1.4.3 肾脏组织病理学检查 肾组织以10%甲醛固定并编号，石蜡包被，2 μm厚连续切片，过碘酸-雪夫(PAS)染色，光镜下观察肾脏病理改变。

1.4.4 免疫荧光法检测HIF1-α的表达 将大鼠肾脏新鲜组织块包埋，液氮中速冻，在恒冷切片机上切成5 μm厚的组织切片。4℃冰丙酮固定30 min，4%小牛血清 37℃温箱封闭30 min，加入兔抗鼠 HIF1-α 多克隆一抗(1∶100)，37℃温箱孵育1 h后，4℃冰箱过夜。次日将切片用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，加入FITC标记的羊抗兔IgG抗体(1∶400，避光)，37℃温箱孵育1 h，PBS浸洗5 min×3次，缓冲甘油封片。使用激光共聚焦显微镜(Olympus IX71)扫描488 nm波长的荧光。将数字化图像储存于计算机，待实验结束后进行图像分析。

1.4.5 原位杂交法检测CTGF mRNA的表达 取2 μm厚石蜡切片，常规脱蜡至水，灭活内源性酶，热修复抗原，抗原抗体反应，DAB显色、脱水、透明、封片、显微镜观察。CTGF mRNA原位杂交所用探针为地高辛标记的针对CTGF基因的多相寡核苷酸探针，按试剂盒说明书进行。阳性产物呈深紫色，不加探针为阴性对照。每张切片随机选取10个高倍视野，每个视野代表0.13 mm2的区域面积，计数CTGF阳性细胞数。

1.5 统计学方法 应用SPSS18.0软件进行t检验及方差分析。

2 结果

2.1 活性维生素D3对进展性肾炎大鼠24 h尿蛋白、肾功能的影响 术后8 w，模型组24 h尿蛋白量、Scr和BUN均显著高于对照组(均P＜0.05)。经活性维生素D3干预治疗后，与模型组比较，24 h尿蛋白量和BUN均显著降低(均P＜0.05)，Scr差异无统计学意义(P＞0.05)。Ca、P水平在活性维生素D3治疗前后无明显差异(P＞0.05)。见表1。

2.2 活性维生素D3对肾组织病理变化的影响 PAS染色显示假手术组肾小管间质形态基本正常。模型组肾小管上皮细胞萎缩、脱落，肾小管管腔扩张、间质水肿，管型堵塞。与假手术组比较，模型组间质炎症和纤维化进行性加重。与模型组比较，治疗组肾小管间质损伤得到改善。见图1。

表1 各项检测指标在各组大鼠中的比较(±s，n=7)

表1 各项检测指标在各组大鼠中的比较(±s，n=7)

与对照组比较:1)P＜0.05;与模型组比较:2)P＜0.05

指标 对照组 模型组 治疗组尿蛋白(mg/24 h) 18.85±3.23 289.18±25.381)131.37±8.652)1.68±0.08 1.59±0.05 1.61±0.07 Scr(μmol/L) 47.45±3.12 165.27±13.351)129.59±7.87 BUN(mmol/L) 8.92±2.73 16.28±4.331)13.02±3.872)Ca(mmol/L) 1.97±0.04 1.89±0.03 1.92±0.06 P(mmol/L)

2.3 活性维生素D3对慢性肾衰竭大鼠肾小管间质HIF-1α表达的影响 HIF-1α主要集中表达于肾小管上皮细胞的胞质，模型组肾小管上皮细胞中HIF-1α表达(2.022±0.254)较对照组(0.268±0.101)显著增多(P＜0.01);应用活性维生素D3治疗后，HIF-1α表达(0.746±0.217)均较模型组明显减少(P＜0.05)，见图2。

2.4 活性维生素D3对进展性肾炎大鼠肾间质CTGF mRNA表达的影响 CTGF mRNA表达主要集中于肾小管上皮细胞和间质细胞的胞质，模型组肾间质CTGF mRNA表达(40.5±13.8)较对照组(20.1±4.0)显著增多(P＜0.01);应用活性维生素D3治疗后，CTGF mRNA表达(61.8±10.2)均较模型组明显减少(P＜0.05)。见图3。

图1 各组大鼠肾间质的组织病理学改变(PAS，×200)

图2 各组大鼠肾间质HIF-1α的变化(免疫荧光，×200)

图3 各组大鼠肾间质CTGF mRNA的变化(原位杂交，×200)

3 讨论

大鼠系膜细胞表达胸腺细胞的抗-Thy-1.1蛋白。给予抗-Thy-1.1抗体后可诱导系膜增生性进展性肾炎的形成。该模型的早期病理改变表现为系膜组织的损伤及在抗体注射后的几小时内出现多形核中性粒细胞和单核细胞在肾小球的聚集〔5〕。近年来发现，进展性肾炎大鼠肾脏组织中存在小管间质持续性的炎症和缺血、缺氧，肾小管-间质细胞的慢性低氧可能在肾纤维化的发生、发展中起重要作用〔6〕。本课题组前期研究显示模型组HIF-1α明显高于假手术组，证实在发生小管间质纤维化前肾小管存在明显慢性缺氧，处于氧化应激状态〔7〕。

活性维生素D的代谢产物1，25-(OH)2-VitD3通过减轻系膜增生性进展性肾炎及残肾模型中肾小球硬化的损伤而发挥了抗肾脏纤维化的作用〔8〕。系膜增生性肾炎模型大鼠是目前观察进展性肾炎比较理想的动物模型〔9〕，本研究说明进展性肾炎大鼠模型造模成功。本研究依据文献资料确定了活性维生素D3的剂量〔10〕，并且该剂量的活性维生素 D3没有引起血Ca、P的变化，排除了维生素D3对Ca、P代谢的影响。予以活性维生素D3干预治疗后发现，活性维生素D3可以通过减少蛋白尿抑制肾脏纤维化，提高肾脏功能。

CTGF可特异刺激间充质来源细胞如成纤维细胞增生，并使细胞分泌细胞外基质如胶原蛋白(Col)Ⅲ、纤连蛋白和α5整合素显著增加。在各种肾脏疾病病人的肾活检组织中，有明显肾间质纤维化病变的局部组织内CTGF表达增加。由于CTGF生物学效应较单一，因此阻断CTGF表达或抑制其活性，可能是一种预防纤维化的有效手段。本研究进一步证实了活性维生素D3可能是通过减少HIF-1α的表达，从而使CTGF表达减少，减轻肾间质纤维化的发生、发展。

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4 査 艳，余芳芳，沈 燕，等.血管紧张素受体拮抗剂在进展性肾炎大鼠模型中对慢性低氧引起肾小管间质损害的抑制作用〔J〕.中国当代医药，2011;18(22):15-8.

5 Takiyama Y，Harumi T，Watanabe J，et al.Tuhular iniury in a rat model of type 2 diabetes is prevented by mefformin:a possible role of HIF-lα expression and oxygen metabolism〔J〕.Diabetes，2011;60(3):981-92.

6 査 艳，胡 英，黄斗全，等.慢性低氧对进展性肾炎大鼠肾小管间质的损害〔J〕.中国当代医药，2011;18(20):14-6.

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9 Manotham K，Tanaka T，Matsumoto M，et al.Evidence of tubular hypoxia in the early phase in the remant kidney model〔J〕.J Am Soc Nephrol，2004;15(5):1277-88.

10 李红芬，林 珊，贾俊亚，等.长期低剂量1，25-二羟基维生素D3对尿毒症大鼠肾脏水通道蛋白2表达的影响〔J〕.中华肾脏病杂志，2013;29(2):124-8.