李 征 杨小明 张天标 娄安锋 (南阳市中心医院泌尿外科，河南 南阳 473000)

膀胱癌发生率位居世界肿瘤的第7位，最常来源于尿路上皮，其癌变因素不仅与吸烟、职业接触等相关，还与肿瘤相关基因和蛋白的致癌作用密切相关。Pygopus-2蛋白是WNT信号通路下游的新功能蛋白，主要通过结合游离β-catenin，使其大量聚集在胞质，并转移到细胞核内，引起靶点的异常活化〔1，2〕。Kruppel样因子(KLF)-4是一种多功能转录因子，表达于多种正常的上皮细胞，可以调节相关细胞的增殖、黏附和侵袭过程，其对肿瘤的作用以抑制为主〔3，4〕。KLF-5与KLF-4的功能相拮抗，常伴随着肿瘤的生长、侵袭和转移发挥一定的协同作用〔5〕。本文关注膀胱尿路上皮癌术后组织中 Pygopus-2、KLF-4和KLF-5的表达特征，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2012年1月至2013年12月我院行膀胱尿路上皮癌根治手术、同时经病理医师确诊的患者97例。均符合WHO中诊断的相关标准。其中男50例，女47例;年龄51～86岁，平均(67.1±5.5)岁。收集研究组中距肿瘤边缘＞5 cm的正常膀胱黏膜组织80例作为对照组，其中男40例，女40例;年龄54～75岁，平均(65.6±4.5)岁。两组一般资料无明显差别。

1.2 Pygopus-2、KLF-4和KLF-5蛋白的检测方法 Pygopus-2、KLF-4和KLF-5蛋白均为浓缩液，依不同比例进行稀释后行预实验，选择最佳的染色效果进行正式实验。蛋白的正式检测应用免疫组化SP法、DAB染色，均由同一病理技师操作，严格按说明书操作，做好质控。

1.3 Pygopus-2、KLF-4和KLF-5结果的判定方法 Pygopus-2、KLF-4和KLF-5均以细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性反应细胞，每张切片中选择5个400倍视野，计数阳性细胞的百分率，取平均值作为最终的阳性率。Pygopus-2、KLF-4和KLF-5均以阳性细胞≥5%定为阳性，以阳性细胞＜5%定为阴性。计算组间阳性率的差别。

1.4 统计学方法 应用SAS6.12统计软件进行χ2检验和线性相关分析。

2 结果

2.1 Pygopus-2、KLF-4和KLF-5蛋白在两组中表达的比较两组中Pygopus-2、KLF-4和KLF-5表达的阳性率差别有统计学意义(P＜0.000 1)。见表1。

2.2 研究组中Pygopus-2、KLF-4和KLF-5蛋白表达与临床特征的关系 研究组中Pygopus-2、KLF-4和KLF-5表达的阳性率与肿瘤的分级、脉管浸润、膀胱周围组织浸润均密切相关。见表2。

2.3 研究组中Pygopus-2、KLF-4和KLF-5表达的相关性分析研究组中KLF-4和KLF-5(r=-0.48，P=0.0319)的表达呈负相关性。其他指标间未见明显的相关性(P＞0.05)。

表1 Pygopus-2、KLF-4和KLF-5蛋白在两组中表达的比较〔n(%)〕

表2 研究组中Pygopus-2、KLF-4和KLF-5蛋白表达与临床特征的关系〔n(%)〕

3 讨论

膀胱的尿路上皮癌常表现细胞形态和结构的异型性，主要为浸润性、有黏聚力的细胞巢，此细胞具有中等量至大量的双嗜色性胞质和大的富含染色质的细胞核。在较大的瘤细胞巢团的边缘可见到栅栏状的细胞核。在肿瘤细胞间可见到数目不等的病理性核分裂象。上述过程常伴随着基因和蛋白的表达失常。Pygopus是在果蝇实验中发现，有两个同源蛋白，即Pygopus-1和Pygopus-2。Pygopus基因位于1号染色体q21.3位置，其编码的产物为含有233个氨基酸的蛋白，Pygopus-2蛋白包括两个独特的保守区域，分别是N端同源序列和C端某-锌指结构〔6，7〕。Pygopus-2在小鼠早期胚胎的乳腺基板形成时已有表达，随着胚胎的发育，Pygopus-2的表达趋于增强，出生后Pygopus-2的表达下降，并逐渐消失，因此认为Pygopus-2是肿瘤胚胎发育和原始细胞增殖的相关蛋白。近来学者进一步研究发现Pygopus2对肿瘤组织发育、转录激活及染色质重塑均有重要作用〔8，9〕，其作用与Pygopus-2结构域能与组蛋白甲基化转移酶复合体相互作用，此时能对组蛋白尾部氨基酸残基进行修饰，并影响组蛋白与DNA的亲和性，改变染色体结构，促进细胞突变及增殖〔10〕。KLF家族能广泛参与细胞的增殖和分化过程，引起肿瘤的发生〔11〕。KLF-4和KLF-5是家族中的重要蛋白，二者在细胞生长分化过程中的作用常相反，一般来说，KLF-4 抑制细胞的生长〔12～14〕，而 KLF-5 则刺激细胞的增殖〔15，16〕。二者通过对细胞的增殖过程进行调节，来发挥对肿瘤生长的促进作用〔17〕。

本实验结果提示Pygopus-2、KLF-4和KLF-5三种蛋白异常表达可以促进肿瘤的发生。Pygopus-2在肿瘤化的过程中大量分泌，其可能是通过 Wnt/β-catenin的作用调节的，也可能是Pygopus-2对增殖过程的调节，使肿瘤恶变加速〔18，19〕。本结果提示三种蛋白异常表达是促进肿瘤进展的重要因素，也提示Pygopus-2和KLF-5高表达、KLF-4低表达可以促进肿瘤的分级、脉管浸润过程及向周围组织的浸润过程。KLF-4和KLF-5可能具有协同负向作用，此点与文献中报道的二者的对抗作用相一致〔20，21〕。KLF-4和KLF-5经常被一起研究，主要因为二者均有KLF因子参与的转录激活作用，但效果常相拮抗。研究认为KLF4对肿瘤的增殖起抑制作用，而KLF-5则对肿瘤细胞的增殖起促进作用〔22〕。有学者在平滑肌细胞的分化过程中，发现KLF-4可以抑制血清反应因子的表达，抑制平滑肌细胞的分化〔23〕。此作用可能与KLF-4对肿瘤的间质反应有关。KLF-4通过结合肌动蛋白基因启动子来抑制相关因子的高表达，进而激活血小板衍生生长因子BB，促进肿瘤的发生和进展。但是关于KLF-4和KLF-5二者对抗的具体调节机制目前并不清楚。

综上，膀胱尿路上皮癌术后组织中Pygopus-2和KLF-5高表达、KLF-4低表达，KLF-4和KLF-5具有协同负向作用，不仅可以促进肿瘤的发生，还对肿瘤的播散及进展有重要意义。

1 De D，Chen A，Wu Z，et al.Overexpression of Pygopus2 protects HeLa cells from vinblastine-induced apoptosis〔J〕.Biol Chem，2009;390(2):157-65.

2 Andrews PG，Lake BB，Popadiuk C，et al.Requirement of Pygopus 2 in breast cancer〔J〕.Int J Oncol，2007;30(2):357-63.

3 吴 钊，陈小鱼，张 能，等.KLF4蛋白在胃癌组织中的表达及临床意义〔J〕.癌变·畸变·突变，2012;1(5):388-90.

4 龚邵新，庄英帜，赵 强，等.KLF4和KLF5蛋白在不同临床分期胃癌组织中的表达及意义〔J〕.中国癌症杂志，2010;20(10):756-8.

5 崔乃鹏，闫伟涛，刘彩云，等.KLF4和KLF5在乳腺浸润性导管癌中的表达及意义〔J〕.临床肿瘤学杂志，2013;18(12):1087-8.

6 Popadiuk CM，Xiong J，Wells MG，et al.Antisense suppression of pygopus2 results in growth arrest of epithelial ovarian cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2006;12(7):2216-23.

7 Roarty K，Rosen JM.Pygopus 2:tilting the Wnt-Notch balance in mammary epithelial lineage determination〔J〕.Breast Cancer Res，2013;15(6):322.

8 Zhou SY，Xu ML，Wang SQ，et al.Overexpression of Pygopus-2 is required for canonical Wnt activation in human lung cancer〔J〕.Oncol Lett，2014;7(1):233-8.

9 Song N，Schwab KR，Patterson LT，et al.Pygopus 2 has a crucial，Wnt pathway-independent function in lens induction〔J〕.Development，2007;134(10):1873-85.

10 黄才权，陈玉英，王占祥.Pygopus蛋白及其与肿瘤相关研究进展〔J〕.实用肿瘤杂志，2011;26(6):651-3.

11 朱海龙，袁卫平，岳惠芬，等.KLF6蛋白在有细胞癌组织中的表达及其意义〔J〕.重庆医学，2013;42(1):33-4.

12 周姝雯，黄翠萍，黄德妤，等.乳腺浸润性导管癌KLF4、P21、P53、APC和CyclinD-1的表达〔J〕.贵阳医学院学报，2013;38(1):50-2.

13 王长武.KLF4在肝细胞癌中的异常表达〔J〕.慢性病学杂志，2010;12(7):580-1.

14 房新辉，杨玉秀，韩双印，等.肝癌组织中KLF4的表达及意义〔J〕.山东医药，2009;49(1):4-6.

15 Han Y，Fukuda N，Ueno T，et al.Role of complement 3a in the synthetic phenotype and angiotensinⅡ-production in vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats〔J〕.Am J Hypertens，2012;25(3):284-9.

16 Ray A，Alalem M，Ray BK.Loss of epigenetic Kruppel-like factor 4 histone deacetylase(KLF-4-HDAC)-mediated transcriptional suppression is crucial in increasing vascular endothelial growth factor(VEGF)expression in breast cancer〔J〕.J Biol Chem，2013;288(38):27232-42.

17 Zhang D，Zhang XL，Michel FJ，et al.Direct interaction of the Krüppellike family(KLF)member，BTEB1，and PR mediates progesterone-responsive gene expression in endometrial epithelial cells〔J〕.Endocrinology，2002;143(1):62-73.

18 陈玉英，王海东，王占祥，等.Pygo2过表达促进大鼠胶质瘤C6细胞增殖〔J〕.中国医科大学学报，2012;41(5):413-5.

19 王海东，杜天明，项永生，等.Wnt信号调控因子Pygo2在人脑胶质瘤中表达及意义〔J〕.中华神经外科疾病研究杂志，2010;9(6):513-5.

20 Matsubara Y，Aoki M，Endo T，et al.Characterization of the expression profiles of adipogenesis-related factors，ZNF423，KLFs and FGF10，during preadipocyte differentiation and abdominal adipose tissue development in chickens〔J〕.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol，2013;165(3):189-95.

21 杨文婷，刘树艳，郑鹏生.转录因子KLF4在宫颈癌中的表达及意义〔J〕.西安交通大学学报(医学版)，2010;31(1):22-4.

22 Suzuki T，Aizawa K，Matsumura T，et al.Vascular implications of the Krüppel-like family of transcription factors〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2005;25(6):1135-41.

23 Sur I，Unden AB，Toftgard R.Human Krüppel-like factor5/KLF5:synergy with NF-kappaB/Rel factors and expression in human skin and hair follicles〔J〕.Eur J Cell Biol，2002;81(6):323-34.