刘 斌 高建东 刘 清

肝癌细胞株中VEGFR活化检测及临床意义

刘 斌 高建东 刘 清

目的 探讨血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)活化检测在肺癌诊治中的应用价值。方法 应用Western Blot法检测HepG2、QGY-7701、SMMC-7721、MHCC97-H和HCCLM3这5种人肝癌细胞株的VEGFR表达及活化前后的含量变化。结果 5种人肝癌细胞株的VEGFR均呈阳性表达，活化后锌指转录因子Snail、Slug和Twist含量显著高于活化前，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论 人肝细胞癌组织中存在VEGFR表达，可以作为肝癌发生发展的一种重要的动态监测指标, VEGFR活化促进肝细胞癌侵袭转移，锌指转录因子是干预肝细胞癌侵袭转移的有效靶点。

血管内皮生长因子；肝癌细胞；活化检测；临床诊断

由于血管生成能够促进肿瘤的发展和转移，研究[1-2]表明，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作为一种重要的刺激因子，在肿瘤血管的形成过程中发挥着非常重要的作用，而VEGF的2个特异性受体VEGFR-1(Flt-1)及VEGFR-2(KDR)活化都能体现癌细胞侵袭和转移的生物学效应。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是含血管最丰富的一种的恶性肿瘤，其VEGF表达必然能提示肿瘤的生长、浸润和转移状况[3]。为探寻肝癌基因治疗中最有效的作用靶点，本研究进行肝癌细胞株的VEGFR蛋白含量及活化前后Snail、Slug、Twist蛋白表达变化的检测，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 5株人肝癌细胞株均购自上海鑫闵生命科学有限公司，分别是上皮样人肝癌细胞HepG2、QGY-7701和SMMC-7721 HHCC，高转移肝癌细胞HCCLM3和MHCC97-H。细胞培养基RPM-1640购自美国Gibco公司，小牛血清购自上海万疆生物技术有限公司，SDS-PAGE凝胶、蛋白上样缓冲液、电泳液均购自北京赛驰生物公司，兔抗人VEGFD多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，人VEGF检测试剂盒购于上海岚派生物公司。

1.2 检测方法

1.2.1 细胞培养 将5种待检人肝癌细胞株置于含有10%小牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPM-1640培养基中生长，孵箱温度控制在37℃，饱和湿度5% CO，细胞长至80%培养皿面积时，以0.125%胰酶消化1min，倒去胰酶，加入新鲜培养基，用单去污剂裂解液裂解细胞。

1.2.2 浓度测定 取对数生长期细胞制成细胞数为5×106/mL的细胞悬液，接种96孔板，加入含不同浓度的VEGF-B培养基。分别用MTT法，以VEGF-Bong/mL的吸光值进行校正，确定VEGF-B浓度为lng/mL是适宜肝癌细胞株的生长[2]。

1.2.3 检测蛋白 (1)电泳：蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，先以100℃沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白。然后冷却到室温后，把30μg蛋白样品加入12.5%SDS凝胶加样孔内，用100V恒压在SDSPAGE电泳液中电泳90～120min，至蛋白被适当分离后即停止电泳。(2)转膜：用Bio-Rad的标准湿式转膜装置(电流为300～400mA)转膜30～60min。(3)封闭：转膜完毕后将蛋白膜放置到Western洗涤液中，漂洗1～2min，真空泵吸尽洗涤液后加入Western封闭液，在室温下封闭60min。(4)一抗孵育：将兔抗人VEGFD多克隆抗体以稀释液按1∶400比例稀释后，将蛋白样品置入其中，在4℃温度下孵育过夜。(5)二抗孵育：将羊抗兔IgG-HRP按1∶2000稀释后在室温或4℃温度下，在侧摆摇床上缓慢摇动孵育60min。(6)蛋白检测：使用BeyoECL Plus显影，用凝胶成像系统扫描各条带灰度值进行半定量分析。以酶标仪测吸光度似值，根据标准品A值求出标准曲线方程。计算出细胞上清中VEGFR浓度。

1.3 统计学方法 对本组研究的数据采用SPSS18.0统计软件进行分析。计量资料采用“x±s”表示，组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGFR蛋白含量 5株人肝癌细胞培养上清液中都检测出VEGF蛋白，以HCCLM3含量最高，达到(741.5±42.8) pg/mL，其余依次为MHCC97-H、SMMC-7721和HepG2，含量分别为(636.4±25.1)、(582.6±18.7)和(540.8±19.2)pg/mL，QGY-7701含量最低，仅为(487.5±13.7)pg，其中，VEGFR-1(Flt-1)在HCCLM3、SMMC-7721、HepG2和MHCC97-H这4种人肝癌细胞株中都呈阳性表达，VEGFR-2(KDR)在HCCLM3、QGY-7701、MHCC97-H和HepG2也呈阳性表达，阳性物质分布在胞膜及胞浆上，为棕黄色。只有QGY-7701和SMMC-7721分别在Flt-1和KDR中为阴性表达。

2.2 肝癌细胞株中VEGFR活化前后锌指转录因子含量变化 无论是Flt-11还是KDR，活化后锌指转录因子Snail、Slug和Twist的含量前均显著高于活化前(P＜0.05)。见表1。

表1 5种肝癌细胞株VEGFR活化前后锌指转录因子含量比较±s,pg/mL)

表1 5种肝癌细胞株VEGFR活化前后锌指转录因子含量比较±s,pg/mL)

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由表1可以看出，5种肝癌细胞株的受体VEGFR话化后，锌指转录因子Snail、Slug和Twist的表达均较活化前明显增加，提示VEGFR活化促进肝细胞癌侵袭转移，锌指转录因子是干预肝细胞癌侵袭转移的有效靶点。

3 讨论

研究[2-4]证实，肿瘤在形成、浸润与转移过程中，新生血管形成发挥了非常关键的重要作用，VEGFR不仅表达在血管内皮细胞中，而且在乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胃癌、结肠癌和胰腺癌等许多实体肿瘤细胞表达增强和不断分泌时，VEGF含量也会显著增加，这一特点在含血管最丰富的肝癌中最为突出，临床检测证实，几乎所有肺癌患者血清的VEGF含量都显著高于健康人群。目前，对肝癌细胞如何突破基底膜侵袭邻近组织，并逐渐向远处转移的机理并不十分清楚，但新生血管生成直接受到血管生成因子调控，因VEGF具有促进血管生成和增加血管通透性的功能，能刺激血管内皮细胞增殖和毛细血管袢的形成，血管新生为肿瘤的生长提供了血供，间质为肿瘤生长提供了适宜的环境，从而为肝癌的侵袭和转移创造条件是必然的[5]。本研究对5种不同的肝癌细胞株进行VEGFR检测，结果发现，所有肝癌细胞株都存在VEGFR表达，并且都集中在上皮样HCC中，尤以高转移肝癌细胞HCCLM3和MHCC97-H含量最高，虽然对其中的原理并不清楚，但足以证实HCC能分泌大量的血管生成因子，以VEGFR检测来诊断肝癌的敏感性和特异性都显著高于文献[1]中报道的其它恶性肿瘤，因此，VEGFR表达可以作为肝癌发生发展的一种重要的动态监测指标。

在VEGF的2个特异性受体中，目前对VEGFR-1被激活能促进癌细胞侵袭和迁移的研究较多，但对VEGFR-2活化后是否也促进癌细胞侵袭和迁移还存在争议，且激活VEGFR在肝癌的发生、发展和侵袭转移中发挥作用的具体机制认识也并不统一，其中VEGFR-1被认为是一种激酶损伤的受体酪氨酸激酶，VEGFR-1能够通过诱导EMT而促进肝癌侵袭和转移，许多不同的细胞外刺激因子能启动EMT和相应的细胞形态学改变已形成共识[5-6]。本研究发现，锌指转录因子Snail、Slug和Twist的表达在VEGFR-1和VEGFR-2活化后明显上调，说明VEGFR活化在肝癌转移和侵袭中发挥了很大作用，这正是由于VEGFR活化诱导肝癌细胞株发生EMT，从而增加癌细胞侵袭和转移能力，当然指转录因子Snail、Slug和Twist如何诱导EMT发生，Snail的机制还有待进一步研究。

治疗HCC是一个非常棘手的问题，目前多以控制转移和复发作为提高效果的途径。从这个意义上说，了解肝癌细胞如何获得侵袭转移潜能有很大临床实用价值。检测VEGFR活化后的含量是为了抑制肝癌细胞的VEGF/VEGFR。一方面，肝癌中很可能存在VEGF自分泌作用途径，通过抑制血管新生能抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡[7]；另一方面，可将VEGFR作为肝癌治疗的一个新的靶点，或通过构建Src寻找VEGFR——EMT信号转导通路，为治疗肝癌侵袭和转移寻找新的作用靶点，这可以为寻找肝癌的治疗探寻一个新的思路[8]。

总之，VEGFR能促进血管内皮细胞的分化和生长，在肺癌新生血管的发生、发展过程中具有重要作用，可以作为肝癌发生、发展和治疗效果的一种重要动态监测指标,VEGFR活化促进肝细胞癌侵袭转移，锌指转录因子是干预肝细胞癌侵袭转移的有效靶点。VEGFR活化检测对肺癌治疗及预后所产生的作用还可进一步研究和探讨。

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[5] 盛赠美,邓永红.非小细胞肺癌血管内皮生长因子表达的临床意义[J].当代医学，2010,16(34)：57-58.

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10.3969/j.issn.1009-4393.2015.19.007

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宁夏 750001 宁夏医科大学总医院外科学研究室 (刘斌) 内蒙古 750333 内蒙古阿左旗吉兰泰医院内科 (高建东) 750001 宁夏医科大学总医院肝胆外科 (刘清)

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