刘春爽,赵朝成,顾莹莹,张云波,刘 芳

(中国石油大学(华东) 化学工程学院,山东 青岛 266580)

实验技术与方法

微生物教学实验中菌株革兰氏染色反应快速判定

刘春爽,赵朝成,顾莹莹,张云波,刘 芳

(中国石油大学(华东) 化学工程学院,山东 青岛 266580)

依据荧光标记的凝集素能够与革兰氏阳性菌细胞壁肽聚糖中的N-乙酰葡糖胺结合,却无法透过革兰氏阴性菌的细胞壁外膜与革兰氏阴性菌肽聚糖层中的N-乙酰葡糖胺结合的特点,提出快速判定菌株革兰氏染色反应的荧光法。针对供试的27株菌,该法革兰氏染色反应判定的准确率高达98.76%,且不受菌龄影响。设置阳性对照抑制实验,有利于提高判定准确率。与常规革兰氏染色法相比,该法具有所需药品少、简单、快速、准确率高的特点,尤其在不可培养样品的革兰氏染色反应判定方面具有很大的应用前景。在微生物教学中可以考虑将该法与传统革兰氏染色法联合使用,以提高教学效果。

微生物学实验;革兰氏染色;凝集素;快速鉴定

革兰氏染色法作为细菌学一种重要的鉴别染色法,目前已成为微生物学实验的基本内容之一。通过该实验不仅能够培养学生的实验技能,而且能够提高学生学习微生物学的兴趣。但革兰氏染色法对操作要求较高,染色结果受涂片厚度、媒染时间、脱色时间等多种因素影响[1-4]。对于初次接触该方法的大学生来说,极易产生假阴性或假阳性结果,严重挫伤学生的实验积极性。为减少革兰氏染色反应的误差率,本文探索了利用荧光标记的凝集素判定菌株革兰氏染色反应的效果。结果表明,该法不仅准确率高、而且具有所需药品少、简单、快速的特点。因此,在微生物教学中可以考虑将该法与传统革兰氏染色法联合使用,以提高教学效果。

1 实验材料与方法

1.1 实验原理

N-乙酰葡糖胺是除支原体属(Mycoplasmasp.)以外所有真细菌肽聚糖中的重要组成成分[5]。革兰氏阳性菌(G+)肽聚糖位于细胞壁的外层,而革兰氏阴性菌(G-)肽聚糖被细胞壁外膜所覆盖(见图1)。凝集素作为大分子物质,能够与革兰氏阳性菌肽聚糖中的N-乙酰葡糖胺直接结合,却不能透过革兰氏阴性菌细胞壁外膜与革兰氏阴性菌的N-乙酰葡糖胺结合[6]。因此,通过检测荧光标记的凝集素与细菌的结合情况,即可判定细菌的革兰氏染色反应。

图1 革兰氏阳性和阴性细菌细胞壁构造的比较

1.2 试剂及菌种

1.2.1 实验菌种

实验选用新培养20 h的大肠杆菌(G-)、炭疽芽孢杆菌(G+)和金黄色葡萄球菌(G+)作为研究对象,考察荧光染色法的效果。为探索菌龄对荧光染色法的影响,实验还考察了培养10、24、48、72、144 h的大肠杆菌、炭疽芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的荧光染色效果。为进一步检验该方法的准确度,实验还研究了革兰氏阳性菌(巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、嗜乳酸杆菌、藤黄微球菌、耻垢分枝杆菌、脲芽孢八叠球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪链球菌、缓症链球菌、产脓链球菌),以及革兰氏阴性菌(乙酸钙不动杆菌、粪产碱杆菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷白氏肺炎菌、摩氏摩根菌、奇异变形杆菌、绿脓杆菌、荧光假单胞菌、施氏假单胞菌、深红红螺菌、液化沙雷菌和粘质沙雷菌)的荧光染色效果。

1.2.2 实验试剂

异硫氰酸荧光素(FITC)标记的麦胚凝集素(WAG)用磷酸盐缓冲液(pH 7.2)稀释至100 mg/L[7]。

1.3 实验步骤

(1) 取洁净载玻片,滴加一小滴无菌水于载玻片中心。将接种环在酒精灯火焰上灼烧,冷却后从斜面上分别挑取少量培养物(大肠杆菌、枯草芽胞杆菌或金色葡萄球菌)与载片上水滴均匀混合后,涂成直径为10～15 mm稀薄圆形菌膜。自然风干后,将载片正面朝上并在酒精灯微小火焰上通过2～3次固定[8]。

(2) 滴加FITC标记的麦胚凝集素,染色30 s,用磷酸缓冲液缓慢冲洗,去水后置于激发波长为495 nm的荧光显微镜下观察[7]。

2 结果与讨论

2.1 荧光染色法效果

为更好地分析荧光染色法效果,实验对比了测试菌株大肠杆菌、炭疽芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌在相差光学显微镜及荧光显微镜下的成像效果,见图2(图中A、B为炭疽芽孢菌,C、D为金黄色葡萄菌,E、F为大肠杆菌)。从图中可以看出：在相差光学显微镜下3种测试菌株均可见；在荧光显微镜下,只有革兰氏阳性的炭疽芽孢杆菌B和金黄色葡萄球菌D可见；革兰氏阴性的大肠杆菌F由于不能与荧光标记的凝集素结合,所以在荧光显微镜下不可见。针对测试菌株,荧光染色法能够判别菌株的革兰氏染色反应,且该方法只需一步荧光染色,与传统革兰氏染色法相比,具有操作简单、快速的特点。

图2 菌株相差显微镜(左)和荧光显微镜(右)分析结果

2.2 菌龄对荧光染色法的影响

与传统的革兰氏染色法不同,菌龄对荧光染色法判定菌株革兰氏反应的效果影响较小,如表1所示。培养10、24、48、72、144 h后,该法仍能准确区分出菌株的革兰氏反应。通常细菌在适宜的培养条件下,十几小时即可进入对数生长期,若菌龄过长,细菌将进入静止期或衰亡期[9]。实验结果表明,菌体细胞未成熟或已经老化,染色结果均不受影响,说明该法对生长缓慢的菌株,如厌氧菌,革兰氏染色反应判定意义很大,且具有直接判定未培养样品革兰氏染色反应的潜力,尤其对不可培养菌株更具有重要的应用价值。

表1 培养时间对荧光染色法的影响

2.3 荧光染色法的准确率

除上述大肠杆菌、炭疽芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌外,实验还探索了另外11株革兰氏阳性菌和13株革兰氏阴性菌的荧光法革兰氏染色反应情况,结果见表2。实验共进行81次荧光染色分析,其中仅有1次出现假阳性,准确率达98.76%。对该假阳性样品进行重新划线、分离,重新进行荧光法分析后,结果正确,说明该样品荧光分析不正确的原因是因为受到污染。

此外,革兰氏阴性菌株绿脓杆菌、荧光假单胞菌、施氏假单胞菌具有自荧光特性[10],在荧光显微镜下能够呈现出微弱的光亮,但此光亮较革兰氏阳性菌株的光亮明显弱,且不受阳性对照抑制实验影响,因此可判定为假阳性。阳性对照抑制实验是在样品固定后,首先滴加未标记的100 mg/L凝集素,作用30 s后洗去,再加标记的100 mg/L凝集素染色30 s,最后荧光显微镜观察[11]。由于滴加的未标记的凝集素先与革兰氏阳性菌肽聚糖层中的N-乙酰葡糖胺结合,即使再次滴加荧光标记的凝集素,也会使对照抑制实验样品的荧光与之前相比受到明显抑制。但假阳性样品却不会出现抑制现象。因此,如果测试样品的荧光较为微弱,可以用阳性对照抑制实验进行佐证。

表2 27株菌荧光法革兰氏染色反应判定结果

3 结论

针对供试的27株菌,荧光法菌株革兰氏染色反应判定的正确率高达98.76%,即使是荧光较为微弱的假阳性样品,也可以通过阳性对照抑制实验进行佐证,提高判定准确率。同时该法受菌龄影响较小,在不可培养样品的革兰氏染色反应判定方面具有很大的应用前景。整体上,该法具有所需药品少、简单、快速、正确率高的特点。因此,在微生物教学中可以考虑引进该法与传统革兰氏染色法联合使用,提高革兰氏染色实验的教学效果,达到培养学生实验兴趣和操作技能的目的。

References)

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[11] Hobbie J E,Daley R J,Jasper S. Use of nuclepore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy[J].Appl Environ Microbiol,1977,33(5):1225-1228.

Fast determination of Gram-stain reaction for strains in microbial experiments

Liu Chunshuang,Zhao Chaocheng,Gu Yingying,Zhang Yunbo,Liu Fang

(College of Chemical Engineering,China University of Petroleum (East China),Qingdao 266580,China)

According to the characteristics that fluorescent-labeled wheat germ agglutinin capable of binding to N-acetylglucosamine in the out peptidoglycan layer of gram-positive bacteria,which could not penetrate the membrane of gram-positive bacteria to bind to N-acetylglucosamine,a fluorescent stain method using flurescent lectin is developed for the fast determination of Gram-stain reaction. For the 27 strains tested,the accuracy of developed method is as high as 98.76% and is not affected by the cell age. Setting positive control inhibition experiments could help to improve the accuracy of the developed method. Compared with the conventional Gram staining,this method has the characteristics of requiring fewer types of drugs,simple,fast and high accuracy,it has great application prospects especially in non-cultured samples. Therefore,in the teaching of microorganisms, it is possible to combine this method with traditional Gram staining to improve the teaching effectiveness.

microbial experiment;Gram-stain reaction;lectin;fast determination

2014- 06- 10 修改日期:2014- 08- 26

城市水资源与水环境国家重点实验室开发基金项目(QA201009)；山东省自然基金项目(ZR2013EEQ030)；中国石油大学教改项目(SY-B201207,SY-B201408)

刘春爽(1981—),女,山东青岛,博士,讲师,硕士研究生导师,研究方向为环境工程微生物.

Q-33

B

1002-4956(2015)1- 0051- 03