付友思，吴又多，陈丽杰

（大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116024）

当今石油资源日渐枯竭，生物发酵法生产石油替代物丁醇重新得到关注[1-2]。与乙醇相比，丁醇具有腐蚀性低、燃烧热高和可直接使用管道输送等优点[3-4]，可以直接代替石油应用到现有汽车发动机，被认为是一种极具潜力的新一代生物能源[5-6]。传统丁醇发酵使用菌株为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），是一种严格厌氧的革兰氏阳性梭状细菌，发酵产物为丙酮、丁醇和乙醇（ABE 发 酵）[7-8]，丙酮丁醇梭菌生长存在明显的“两相”过程，即产酸期和产溶剂期，产酸期菌体消耗底物快速生长，产生乙酸和丁酸；产溶剂期菌体重新吸收细胞外有机酸转化为丙酮、丁醇和乙醇[9-10]。细胞内未解离的分子态丁酸（UBA）浓度是影响产酸期转变为产溶剂期的关键因素之一[11]，Terracciano 等[12]认为发酵过程由产酸期进入产溶剂期的条件是细胞内分子态丁酸浓度为13～18mmol/L。有报道发现向ABE 发酵培养基中添加丁酸会抑制发酵过程丁酸的生成，并能够促进吸收细胞外丁酸，增加了细胞内丁酸磷酰化水平，进而显著提高ABE 发酵过程中底物糖转化率、有机溶剂的产量和产率[13-14]。

已有研究工作表明金属元素对丙酮丁醇发酵具有重要的调控作用，锌（Zn）是微生物代谢过程中重要金属元素，是许多关键酶的辅基[15]，如碱性磷酸酶和乙醇脱氢酶[16-17]。作者课题组前期工作发现在向发酵培养基中添加0.001g/L ZnSO4·H2O 条件下，能够显著提高丁醇发酵底物糖利用率和菌体代谢速率，可以促进有机酸重吸收作用，缩短发酵时间，进而提高丁醇及总溶剂产量、产率和转化率[18]。此外，已有研究证明在发酵培养基中添加4.0g/L 碳酸钙（CaCO3）对丙酮丁醇发酵有重要的调控作 用[19]。事实上，CaCO3的调控作用在丁醇发酵中主要表现在两方面，一方面Ca2+是蛋白酶激活剂，能改变细胞膜通透性，增强菌体丁醇耐受性；另一方面CO32-表现出有效的pH 缓冲作用[20]。除金属元素Zn 和Ca 之外，锰（Mn）被认为是微生物所必须金属元素之一[21]，同时还是一些酶的辅助因子，如ABE 发酵代谢过程中的乙酸激酶（AK）的活性需要锰离子[22]，这些金属元素各自对丙酮丁醇发酵有着重要的调控作用，然而目前尚未有针对Zn2+、Ca2+和Mn2+协同调控丙酮丁醇发酵的研究报道。本文研究了Zn2+、Ca2+和Mn2+3 种金属离子对ABE发酵的协同调控作用，并进一步研究在3 种金属离子共存条件下对丁酸代谢的影响。

1 实验材料和方法

1.1 菌种

本实验室驯化保存的丙酮丁醇梭状芽胞杆菌Clostridium acetobutylicumL7。

1.2 培养基组成

活化培养基（g/L）：胰蛋白胨30，葡萄糖20，酵母粉10，自然pH 值。

摇瓶/种子培养基（g/L）：葡萄糖70，乙酸铵3.2，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，对氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，自然pH 值。

发酵培养基（g/L）：葡萄糖70，乙酸铵3.2，K2HPO40.5，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·H2O 0.01，对氨基苯甲酸0.01，生物素0.01，初始pH 值5.5。

以上培养基通入氮气除氧，121℃蒸汽灭菌15min。

1.3 培养方法

菌种活化：将冷冻保藏的5mL 菌种温育后接种于100mL 活化培养基中，37.5℃厌氧培养20h，用于种子及摇瓶发酵培养。

种子培养：将活化好菌种以体积比10%的接种量接种于100mL 种子培养基中，于温度37.5℃厌氧培养24h，用于发酵罐培养。

摇瓶发酵培养：将活化好菌种以体积比10%的接种量接种于 100mL 摇瓶培养基中，于温度37.5℃，150 r/min 摇床培养72h。

发酵罐培养：将活化好的种子培养基以体积比10%的接种量接种于1 L 发酵培养基中，于温度37.5℃，150 r/min 培养72h。

1.4 分析方法

葡萄糖浓度测定使用葡萄糖分析仪（SBA-40C生物传感分析仪）：将发酵上清液中葡萄糖浓度稀释到1g/L 以下，取25µL 进样，根据传感仪读数及稀释倍数计算出样品中葡萄糖浓度。

生物量测定方法：在620 nm 处测定菌体的吸光度（OD620）作为菌体浓度。

使用气相色谱HP-INNOWAX（19091N-233）测定溶剂各组分，FID 检测器。色谱条件：毛细管色谱柱（30m×0.25mm×0.50 μm），柱温100℃；进样温度250℃；FID 检测器温度300℃，H2流速40mL/min，空气流速400mL/min；载气N2流速30mL/min；进样量0.1μL，分流比50∶1。采用内标法定量，内标物为异丁醇。

乙酸和丁酸浓度使用Waters 1525 高效液相色谱测定，色谱分离条件：Aminex HPX-87H 有机酸分析柱（30cm×7.8mm；Bio-Rad，Hercules），流动相为5mmol/L H2SO4，流速0.5mL/min，进样量20µL，柱温50℃，检测波长210nm。

2 实验结果与讨论

2.1 添加Zn2+和Ca2+对ABE 发酵的影响

根据前期研究结果，Zn2+或Ca2+对ABE 发酵存在显著调控作用[18-19]，二者都能够有效提高ABE发酵有机溶剂产量，然而二者共同存在条件下的ABE 发酵尚无研究揭示。因此，本研究在0.001g/L ZnSO4·7H2O 和4.0g/L CaCO3共同添加条件下，进行批次发酵，研究Zn2+和Ca2+添加对ABE 发酵的影响，结果如图 1 所示。结果表明，向培养基中添加0.001g/L ZnSO4·7H2O 和4.0g/L CaCO3能够促进菌体细胞生长，发酵至28h 时菌体最大生长浓度OD620为5.43，与单独添加Zn2+或Ca2+相比分别提高23.41%和 8.17%，至48h 葡萄糖基本消耗殆尽，残糖浓度为1.51g/L，发酵体系氧化还原电位（ORP）在发酵8h 迅速下降至-517mV，此后在发酵至48h的时间内稳定在-560～-550mV，在此过程中丁醇及总溶剂呈现快速累积状态，丁醇及总溶剂最高产量分别达到14.41g/L 和23.69g/L，与单独添加Zn2+相比提高14.64%和13.68%，与单独添加Ca2+相比略有提高，丁醇的比生成速率达到0.23g/(g·h)；发酵终点乙酸和丁酸浓度为2.33g/L 和1.02g/L，乙酸浓度与单独添加Zn2+或Ca2+相比有所降低，而丁酸浓度与单独添加Zn2+相比提高49.02%，但与单独添加Ca2+相比降低，表明Ca2+存在能够增加有机酸积累，而Zn2+存在能够有效降低有机酸积累。综上所述，共同添加Zn2+和Ca2+能够促进底物糖吸收利用和菌体细胞生长，显著降低发酵终点葡萄糖浓度，并进一步提高ABE 发酵终点丁醇及总溶剂的产量，发酵性能均优于单独添加Zn2+或Ca2+条件下的丙酮 丁醇发酵，即Zn2+和Ca2+对ABE 发酵存在显著协同调控作用。

图1 共同添加0.001g/L ZnSO4·7H2O 和4.0g/L CaCO3 条件下的ABE 发酵

2.2 Zn2+和Ca2+存在条件下Mn2+对ABE发酵的 影响

已有研究发现Mn2+对丙酮丁醇发酵过程中关键酶存在调控作用[22]，为进一步提高ABE 发酵丁醇及总溶剂产量，在Zn2+和Ca2+添加条件下研究Mn2+对丙酮丁醇发酵的影响，结果如图 2 所示。结果表明，不添加MnSO4·H2O 时，丁醇产量仅为10.48g/L，与对照组（添加0.01g/L MnSO4·H2O）12.46g/L 相比降低1.98g/L，随着MnSO4·H2O 添加浓度的升高，丁醇产量逐步提高，表明Mn2+的添加对丁醇产量有促进作用，当MnSO4·H2O 浓度达到0.8g/L 时，丁醇最高产量为13.48g/L，与对照组相比提高1.02g/L，继续增大MnSO4·H2O 添加浓度，丁醇产量呈下降趋势。MnSO4·H2O 浓度达到0.8g/L时，发酵液中乙酸和丁酸浓度分别为0.25g/L 和3.03g/L，与对照组相比分别降低了 0.56g/L 和0.78g/L。以上研究结果表明在Zn2+和Ca2+同时存在基础上，再添加0.8g/L MnSO4·H2O 能够进一步提高丁醇及总溶剂产量，并降低发酵终点有机酸副产物浓度。

图2 Zn2+和Ca2+存在条件下MnSO4·H2O单因素发酵 实验

2.3 添加Zn2+、Ca2+和Mn2+批次发酵实验

为探究共同添加Zn2+、Ca2+和Mn2+对ABE 发酵过程的协同调控作用，在0.001g/L ZnSO4·7H2O、4.0g/L CaCO3和0.8g/L MnSO4·H2O 共同添加条件下进行了ABE 批次发酵实验，结果如图 3 所示。发酵至48h 葡萄糖基本消耗殆尽，发酵终点葡萄糖浓度为2.56g/L，底物葡萄糖基本消耗殆尽。至26h最大菌体生长浓度OD620为3.47，与同时添加Zn2+和Ca2+条件相比降低1.96，ORP 在发酵前8h 迅速下降至-524mV，此后在发酵至54h 的时间内稳定在-560～-550mV，在此过程中丁醇及总溶剂快速累积，ORP 在54h 开始回升，ORP 相对于同时添加Zn2+和Ca2+条件维持在更低水平，表明发酵体系中 有机酸积累得到缓解，丁醇及总溶剂代谢合成旺盛，最终丁醇及总溶剂产量分别达到 14.56g/L 和23.70g/L，丁醇的比生成速率达到0.48g/(g·h)，与同时添加Zn2+和Ca2+条件相比提高了108.69%，表明Zn2+、Ca2+和Mn2+的添加有效提高了菌体细胞代谢合成丁醇的能力。此外，发酵终点乙酸和丁酸浓度为1.99g/L 和0.54g/L，与同时添加Zn2+和Ca2+条件相比分别降低14.59%和47.06%，显著缓解了发酵终点有机酸积累现象。综上所述，金属离子Zn2+、Ca2+和Mn2+的添加对ABE 发酵存在正向协同调控作用，能够有效促进有机酸重吸收，最终解决发酵终点有机酸副产物积累过多问题。

图3 Zn2+、Ca2+和Mn2+共同存在条件下的ABE 发酵

2.4 Zn2+、Ca2+和Mn2+协同调控作用对丁酸代谢的影响

本研究发现Zn2+、Ca2+和Mn2+的协同调控作用可以促进ABE 发酵过程丁酸重吸收作用，显著降低发酵终点丁酸浓度，由此在初始培养基和Zn2+、Ca2+和Mn2+共同存在条件下添加丁酸进行研究，实验结果如表 1 所示。结果表明，Zn2+、Ca2+和Mn2+共同存在条件发酵终点葡萄糖残余浓度随着添加丁酸增多逐渐增加，最大菌体生长浓度OD620先增加后减少，当添加1.9g/L 丁酸时OD620达到4.17，相比不添加丁酸条件提高20.17%，丁醇及总溶剂产量分别达14.82g/L 和24.32g/L，与不添加丁酸条件相比略有提高。表明添加1.9g/L 丁酸能够促进菌体的生长，提高丁醇及总溶剂产量。

在相同浓度丁酸添加条件下，Zn2+、Ca2+和Mn2+共同存在条件发酵终点丁酸浓度均少于空白对照，说明Zn2+、Ca2+和Mn2+同时存在能够有效的增强ABE 发酵菌体丁酸重吸收代谢能力。随着丁酸添加浓度的增加，乙酸生产得到增强，这可能是因为菌体生长所需要的ATP 来自乙酰和丁酰磷酸化过 程[23-24]，1mol 葡萄糖转化为乙酸或丁酸分别可产生4mol 或3mol ATP[25]，少量丁酸添加会增强乙酰和丁酰磷酸化过程，对菌体生长和溶剂生成有着促进作用，然而过多的添加丁酸使得丁酰磷酸化受到抑制，菌体生长所需ATP 只能由乙酰磷酸化过程提供，因此乙酸产量逐步增多，但菌体生长所需ATP不足，从而抑制菌体生长，导致丁醇及总溶剂产量减少。

表1 不同浓度丁酸添加条件下的ABE 发酵

因为未解离的分子态乙酸和丁酸能够自由的穿过细胞膜，所以细胞内乙酸和丁酸浓度等于细胞外分子态乙酸（UAA）和丁酸（UBA）浓度[26]。发酵过程中监测记录 pH 值，可根据 Henderson- Hasselbalch 方程[13]计算出分子态乙酸和丁酸浓度。如图 4 所示，在Zn2+、Ca2+和Mn2+同时存在条件下，随着所添加丁酸浓度的提高（1.9g/L、3.8g/L 和5.6g/L），发酵过程中分子态乙酸和丁酸浓度相应增加，而当添加丁酸浓度提高至7.5g/L 时，分子态乙酸和丁酸浓度反而下降，总分子态有机酸最高浓度分别为41.26mmol/L、48.09mmol/L、55.64mmol/L和41.67mmol/L。有研究报道发现，当发酵体系中总分子态有机酸浓度超过57～60mmol/L 时，会出现菌体代谢停滞，残余糖浓度较高，发酵提前终止的现象，即“酸崩溃”现象[26]，在本研究工作中，不同丁酸添加条件下总分子态有机酸浓度均低于上述 阈值，未发生“酸崩溃”的现象，因此发酵能够顺利 进行。

图4 不同浓度丁酸添加条件下分子态乙酸和分子态丁酸 过程变化

以上结果表明Zn2+、Ca2+和Mn2+同时存在能够有效的增强ABE 发酵菌体丁酸重吸收代谢能力，少量丁酸添加条件下能够提高菌体活性和丁醇及总溶剂产量，并在较多丁酸添加条件下，能够重吸收更多有机酸，从而保持一定菌体活性，避免“酸崩溃”的发生。

3 结 论

（1）ABE 发酵过程共同添加 0.001g/L ZnSO4·7H2O 和4.0g/L CaCO3时，丁醇及总溶剂产量达到14.41g/L 和23.69g/L，与单独添加Zn2+相比提高14.64%和13.68%，与单独加Ca2+相比略有提高，发酵终点乙酸和丁酸浓度为2.33g/L 和1.02g/L，表明Ca2+存在能够增加有机酸积累，而Zn2+存在能降低有机酸积累。

（2）ABE 发酵过程共同添加 0.001g/L ZnSO4·7H2O、4.0g/L CaCO3和0.8g/L MnSO4·H2O时，丁醇及总溶剂产量达到14.56g/L 和23.70g/L，丁醇比生成速率达到0.48g/(g·h)，相对于同时添加Zn2+和Ca2+条件的0.23g/(g·h)提高了108.69%，发酵终点乙酸和丁酸浓度为1.99g/L 和0.54g/L，与同时添加 Zn2+和 Ca2+条件相比分别降低 14.59%和47.06%，有效解决有机酸副产物积累过多问题。

（3）在Zn2+、Ca2+和Mn2+共同存在条件下，添加1.9g/L 丁酸时，菌体最大生长浓度OD620达到4.17，丁醇及总溶剂产量分别达到 14.82g/L 和24.32g/L，在发酵过程中，Zn2+、Ca2+和Mn2+的协同调控作用有效提高菌体细胞对丁酸的重吸收 能力。

综上所述，Zn2+、Ca2+和Mn2+3 种金属离子对丙酮丁醇发酵存在显著正向协同调控作用，有效提高菌体细胞代谢合成丁醇的能力，促进有机酸，尤其是丁酸重吸收，降低发酵终点有机酸副产物的积累，最终提高丙酮丁醇发酵性能。优化丙酮丁醇发酵培养基中金属元素组成是一种简单有效的过程优化手段，为ABE 发酵法高效生产丁醇及总溶剂提供了重要参考和技术支持。

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