刘臻 曹定睿

丙泊酚后处理对大鼠肝缺血再灌注损伤时肾细胞凋亡以及Bcl-2，Bax的影响

刘臻 曹定睿

目的 评价丙泊酚后处理对大鼠肝缺血再灌注时远隔脏器肾脏细胞B淋巴细胞瘤/白血病-2（Bcl-2），Bcl相关X蛋白（Bax）的影响。方法 健康雄性SD大鼠54只，随机分为3组（n=18）：假手术（S）组、缺血再灌注(IR)组、丙泊酚(P)组。每组再根据再灌注时间（2、4、6h）的不同各分成3个亚组，分别为S2、S4、S6、IR2、IR4、IR6、P2、P4、P6亚组。制备70%肝缺血再灌注模型，测定血液中胱抑素C（Cys-c），利用免疫组化方法检测各组肾组织中Bcl-2蛋白和Bax的表达，TUNEL法检测肾脏细胞的凋亡指数(AI)。结果 各组同一时间点相比，IR组和P组的Cys-c、Bcl-2、Bax蛋白含量，AI值均显著高于S组（P＜0.05）。P组的Bcl-2、Bcl-2/Bax显著高于IR组，Bax、Cys-c、AI值显著低于IR组（P＜0.05）。结论 丙泊酚对肝缺血再灌注时肾脏损伤有保护作用，而其保护机制可能与调控Bcl-2、Bax蛋白的表达有关。

丙泊酚；肝缺血再灌注；肾损伤

肝缺血再灌注损伤(HIRI)是临床外科常见的病理生理过程，可见于肝肿瘤切除、肝移植等手术。HIRI不仅会直接损伤肝脏本身，还会引起包括肾脏在内的其他远隔脏器损伤[1]。而细胞凋亡在缺血再灌注（IR）损伤中发挥重要作用[2]。Bcl-2,Bax作为调控凋亡的蛋白，其表达水平间接反映了凋亡的情况，其中两者此消彼长的关系与凋亡的程度密切相关[3]。丙泊酚因具有清除自由基的功效，从而可以产生一定的抗氧化作用[4]。肾脏是清除Cys-c的唯一场所，故肾小球滤过率决定了血清中Cys-c的浓度，且不受其他干扰因素(如炎症、感染等)的影响。因此，Cys-c敏感性好、特异性高，可更好地反映肾小球滤过功能[5]，其浓度变化可体现肾脏的功能状态。丙泊酚对肝缺血再灌注时肝脏的保护作用已得到肯定。已有研究发现HIRI发生时可以造成肾脏一定程度的损伤。目前，对HIRI的保护研究已从之前的关注肝脏本身发展到关注肝损伤时其他远隔脏器的损伤，本研究通过建立HIRI模型，了解HIRI后肾脏的功能状态，探讨丙泊酚在HIRI中是否对肾脏有保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康成年雄性SD大鼠54只（体质量

180～250g，购自山西医科大学实验动物中心）。丙泊酚注射液（Astra Zeneca公司，意大利，批号JY174）。免疫组化试剂盒、原位细胞凋亡试剂盒、DAB染色试剂盒pv-6000（北京中杉金桥生物技术有限公司）。Bcl-2兔抗多克隆抗体（博士德生物公司，BA0414）。Bax兔抗多克隆抗体（博士德生物公司，BA0315）。

1.2 模型制备 大鼠于实验前禁食12h，25%乌拉坦（1g/ kg）腹腔注射麻醉，平卧固定，消毒，上腹部正中切口，逐层分离显露第一肝门后，暴露肝蒂、左、中叶，无创伤夹闭肝脏左、中叶的门静脉，肝动脉分支，保留右叶、乳突叶、尾状叶门静脉分支。肝脏左，中叶表面颜色变灰显示建立70%肝缺血模型成功。夹闭1h后恢复灌注，灰色部位恢复红润为再灌注成功标志。

1.3 实验分组 54只大鼠随机分为3组（n=18）：假手术（S）组、缺血再灌注(IR)组、丙泊酚(P)组。每组再根据再灌注时间（2、4、6h）分成3个亚组：分别为S2、S4、S6、IR2、IR4、IR6、P2、P4、P6共9个亚组。

1.3.1 假手术（S）组 仅暴露肝门，不做其他处理。尾静脉以0.3mL/(kg·min)的速率持续泵注0.9%的生理盐水10min，1h后关闭腹腔，此时刻视为再灌注起点，于2h时对S2组的6只大鼠行游离左肾，结扎肾蒂，取左肾标本，心室取血后当即离心，冷冻保存，处死动物。同样4h时得到S4组的6份标本，6h时得到S6的6份肾及血清标本。

1.3.2 缺血再灌注(IR)组 暴露肝门，夹闭相应动静脉，造成肝缺血损伤，同样以0.3mL/(kg·min)的速率持续泵注0.9%的生理盐水10min，1h后再灌注。分别在上述各时刻得到IR2、IR4、IR6亚组的血清及肾组织标本。

1.3.3 丙泊酚(P)组 暴露肝门，夹闭相应动静脉造成肝缺血损伤，以3mg/(kg·min)的速率持续泵注丙泊酚注射液10min，1h后再灌，得到P2、P4、P6亚组标本。

1.4 肾组织病理检查 取左肾下极组织甲醛固定，石蜡包埋，切片，染色，光镜下观察肾组织细胞形态。

1.5 肾组织Bcl-2,Bax蛋白含量测定 利用免疫组化二步法，检测其表达情况。显微镜下每张切片随机选取5个视野观察，通过美国aperio公司的scanscope数字病理扫描系统软件分析，得到阳性区域平均光密度（optical density OD）值。OD值的高低反映Bcl-2,Bax蛋白含量的表达水平。

1.6 原位细胞凋亡检测 用TUNEL法对肾组织切片细胞凋亡行原位检测，每个标本随机选取5个视野，计算AI。

1.7 血清胱抑素检测 抽取样本后分离血清，冷冻保存，采用全自动血液生化分析仪(COBAS 501)测定Cys-c的浓度。

1.8 统计学方法 采用SPSS19.0软件包对数据进行分析。各组实验数据均以“x±s”表示。不同组间比较采用单因素方差分析，若结果差异有统计学意义，则继续采用SNK检验进行进一步比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 组织病理学结果 S2、S4、S6亚组肾小球与肾小管均未发生明显形态学改变，IR2、IR4、IR6各亚组肾小管的上皮细胞明显肿胀变形，空泡样改变，间质水肿，肾小管扩张，有部分脱落坏死细胞，可见管型，炎细胞浸润，肾小管周围血管淤血扩张明显。P2、P4、P6亚组少量肾小管上皮细胞轻度水肿，管型罕见，肾小管周围轻度淤血，极少炎细胞浸润。

2.2 肾组织中Bcl-2,Bax蛋白含量及AI变化 所有结果进行组间比较。同一时刻，与S组比较，IR、P组Bcl-2,Bax蛋白含量，AI值显著增加（P＜0.05）；与IR组相比，P组Bcl-2含量、Bcl-2/Bax值显著增加，Bax含量、AI值显著减少（P＜0.05）。见表1。

表1 3组不同时相肝组织Bcl-2蛋白、Bax蛋白及其比值(x±s)

2.3 血清中Cys-c含量变化 所有结果进行组间比较。同一时刻，与S组比较，IR,P组Cys-c含量显著增加(P＜0.05)；与IR相比，P组Cys-c值显著减小(P＜0.05)。见表2。

3 讨论

缺血再灌注损伤的机制目前并未完全研究彻底，可能与细胞凋亡，氧自由基爆发性产生、钙超载等有关，丙泊酚作为目前临床广泛应用的静脉麻醉药已经证实有抑制细胞炎症因子释放和抗氧化作用[7]。并在HIRI中对凋亡具有明确的抑制作用[8]。

本研究结果显示，同一时刻，与IR组比较，P组Cys-c显著降低，Bcl-2/Bax显著降低，肾组织损伤程度减轻，且Bcl-2蛋白含量显著增加，Bax蛋白含量显著减少，提示丙泊酚对HIRI时肾脏的保护作用很可能与调控Bcl-2,Bax蛋白的表达相关，Bcl-2蛋白主要位于线粒体外膜，与抑制细胞凋亡有关，Bax蛋白位于胞质，起到促进细胞凋亡的作用。两者的比例决定了细胞凋亡的程度。

综上所述，丙泊酚通过上调Bcl-2，下调Bax的表达，使Bcl-2/Bax比值升高抑制凋亡，减轻损伤，丙泊酚后处理对HIRI时肾脏的损伤具有保护作用，可能与调控Bcl-2,Bax蛋白表达发挥作用，但具体的调控机制还有待进一步研究。

表2 3组不同时相AI及Cysc（x±s）

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Objective To investigate the effect of post-conditioning with Propofol on apoptosis and the expression of bcl-2,bax gene in renal tissue after hepatic ischemia-reperfusion injury and its mechanism. Methods Fifty-four healthy male SD rats were randomly divided into three groups, including sham group (S), ischemia-reperfusion group (IR), propofol group (P). According to the different periods after reperfusion, each group was further divided into 2-hour 4-hour and 6-hour reperfusion subgroups respectively (n=6 in each subgroup), named S2、S4、S6 subgroups,andI R2、IR4、IR6 subgroups, and P2、P4、P6 subgroups. Make the 70% hepatic ischemia-reperfusion model. The blood was sampled at the end of ischemia-reperfusion for assay of cystatin c（Cys-c）the apoptosis rate(AI) in ischemia-reperfusion renal tissure were measured by TUNEL method; the bcl-2,bax concentration were measured by immuno-histochemistry. Results Different group compared to the sametime. Blood concentrations of Cys-c ,AI, and the amount of bcl-2 and bax protein after reperfusion in group IR, and group P were higher than those in group S at matched reperfusion time points (P＜0.05).The amount of bcl-2 and bcl-2/bax in group P were higher than those in group IR, but the amount of bax, AI and the concentrations of Cys-c in group P were lower than those in group IR (P＜0.05). Conclusion Propofol can alleviate renal injury induced by hepatic ischemia-reperfusion in rats, in which the bcl-2 and bax protein may play important roles.

Propofol; Hepatic ischemia-reperfusion; Renal injury

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.23.008

山西 030001 山西医科大学附属一院麻醉科 （刘臻 曹定睿）

曹定睿 E-mail:cdr128@126.com