陈琼琼，涂珍珍，王　瑞，张思平，赵　盼，成　芳，查晓军，周海胜

LCE3C在皮肤癌组织中分布和细胞定位及其调控机制的初步研究

陈琼琼1，涂珍珍1，王瑞1，张思平2，赵盼1，成芳1，查晓军1，周海胜1

摘要目的研究LCE3C蛋白在皮肤鳞状细胞癌（SCC）以及基底细胞癌（BCC）中的分布及其调控的分子机制。方法

免疫组织化学法检测LCE3C在SCC和BCC组织中的表达。构建绿色荧光蛋白融合表达的LCE3C重组表达载体pLCE3C-GFP，转染人SCC细胞系A431，采用激光共聚焦显微镜分析LCE3C在A431细胞中的定位。Western blot法检测转录因子GRHL3对LCE3C表达的影响。结果免疫组化结果显示，与正常皮肤组织比较，LCE3C在SCC和BCC组织中表达明显增加；在皮肤癌组织中LCE3C主要分布在表皮的角质层。激光共聚焦结果显示，LCE3C主要分布在细胞外基质（ECM）中；Western blot结果显示，与角质形成细胞（HaCaT）比较，A431细胞中GRHL3表达量显著降低，而LCE3C表达量明显增高；过量表达GRHL3的细胞（A431／GRHL3）LCE3C表达量显著降低。结论与正常皮肤组织比较，LCE3C在皮肤癌中的表达增加，主要分布在皮肤角质层的ECM；转录因子GRHL3与皮肤癌组织LCE3C的表达呈负相关性。

关键词LCE3C；皮肤鳞状细胞癌；基底细胞癌；细胞定位

全基因组关联分析研究［1］显示位于人染色体1q21区域中的晚期角质化包膜蛋白（late cornified envelope，LCE）基因与中国汉族人的银屑病易感性明确相关。LCE基因的主要功能是参与皮肤角化层的构成。功能研究［2］显示LCE3C基因的缺失是诱发银屑病的危险因素。皮肤癌是一种常见的皮肤肿瘤，如皮肤鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma，SCC）和基底细胞癌（basal cell carcinoma，BCC），角质形成细胞的过度增殖和异常分化等与银屑病有相似特点。关于LCE3C在皮肤癌中的表达水平及其调控表达的分子机制鲜有报道。GRHL3作为一种转录因子，在胚胎发育过程中参与上皮细胞迁移，与神经管闭合有关［3］，而且参与成人表皮划痕的损伤修复［4］。在表皮的正常分化过程中，基底层细胞会由先前的未分化状态逐渐发展成熟，GRHL3在这一过程中可以促进表皮基底层细胞特异性基因的表达［5］。该研究通过观察LCE3C在皮肤癌的表达变化及其细胞分布，初步探讨GRHL3是否参与调控LCE3C表达，进一步探讨LCE3C在皮肤癌的发病过程中作用及其分子机制。

1　材料与方法

1．1材料

1．1．1组织标本、细胞系与载体

人皮肤癌组织标本由安徽医科大学附属省立医院病理科提供，其中SCC和BCC组织标本各12例；正常皮肤组织标本5例，均取自安徽医科大学附属省立医院泌尿外科门诊包皮环切手术患者；人SCC细胞株A431和人永生化角质形成层细胞株HaCaT由安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室实验室冻存；过量表达GRHL3的A431细胞（A431／GRHL3）由本实验室建立；pEGFP N1载体由本实验室冻存；人LCE3C cDNA的质粒由厦门大学韩家淮教授惠赠。

1．1．2培养基及试剂

高糖DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、青霉素／链霉素（P／S）均购自美国Hyclone公司；Lip2000（LipofectaminTM2000）购自美国Invitrogen公司；G418、DAPI染色液均购自上海碧云天生物技术有限公司；Top 10感受态细胞、质粒小提试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker、DL 15 000 DNA Marker、NheⅠ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶和SYBRⓇPremix Ex TaqTM均购自日本TaKaRa公司；通用型SP检测试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；蛋白Marker、超敏SuperSignalⓇWest Pico均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；兔源抗LCE3C、鼠源抗GAPDH均购自美国Abcam公司；兔源抗GRHL3、羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgGHRP均购自美国Santa Cruz公司。

1．2方法

1．2．1免疫组化

组织切片（4μm）常规脱蜡入水

2015－05－25接收

230032

2安徽医科大学附属省立医院皮肤科，合肥230001

1．2．2载体构建

按1∶150的比例扩增含LCE3C cDNA的质粒菌液，培养过夜后提取质粒；根据Gen-Bank提供的人LCE3C基因mRNA的序列（GenBank序列号：NM＿178434．2），利用Primer 5．0软件，设计引物（上游引物：5′-CTAGCTAGCTATGTCCTGCCAGCAAAAC-3′，下游引物：5′-CCGCTCGAGCGG GCAGCAGCCCCCAGAGC-3′），在上游和下游引物的5′末端分别引入内切酶NheⅠ和XhoⅠ的识别序列。PCR扩增目的片段，1%琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段，用T4 DNA连接酶连接LCE3C目的片段和pEGFPN1载体，然后转化到Top 10中，平板克隆后挑取菌落扩大培养，PCR鉴定，提取质粒，经NheⅠ、XhoⅠ双酶切后，选取目的片段大小一致的克隆，送上海生工生物工程股份有限公司测序。

1．2．3构建细胞系

将重组表达载体pLCE3C-绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）用脂质体Lip2000转染到A431细胞中，转染2 d后，可见部分细胞有绿色荧光，改用含400μg／ml G418的DMEM培养基筛选细胞；筛选1个月后，换用含有1%P／S、10%FBS的高糖DMEM继续培养，冻存。1．2．4激光共聚焦实验

按一定的比例将A431细胞传至铺有无菌玻璃片的12孔板，使细胞可以在第2天融合至70%～80%，转染前将细胞饥饿处理6～8 h；按照Lip2000说明书分别向2孔细胞瞬时转染pLCE3C-GFP和pEGFP N1做对照；48 h后，荧光显微镜（XDS-3FL，意大利Optika公司）下观察到大部分细胞有荧光，PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定，DAPI染核，最后取出板底的玻璃片，倒扣在载玻片上，激光共聚焦显微镜（SPS-DMI6000-DIC，德国徕卡公司）观察、拍片。

1．2．5Western blot法检测

收集细胞总蛋白，制备SDS-PAGE凝胶，上样后电泳，待目的蛋白充分分离至不同位置后移至PVDF膜上，室温封闭45 min，4℃过夜孵育一抗LCE3C（1∶1 000）。次日PBST洗涤3次，室温HRP标记的二抗6～8 h，TBST洗涤后，加入超敏，暗室中X线片曝光，最后用Image J软件对目的条带进行灰度分析。

1．3统计学处理

2　结果

2.1免疫组化检测LCE3C在SCC和BCC组织中的分布及表达

免疫组化结果显示，正常皮肤组织表皮层仅少量着色，表皮各层之间着色差异无统计学意义；而SCC和BCC患者皮肤组织表皮层着色显著，但细胞鲜少着色，棕黄色沉淀主要集中在细胞外基质（extracellular matrixc，ECM），同时LCE3C在表皮各层之间的分布差异有统计学意义，相比基底层、棘层、颗粒层、表皮的最外层，即角质层着色最深，提示皮肤癌组织表皮层LCE3C表达明显增加，主要分布在角质层。其中12例SCC的IOD值（29．775±1．630）和12例BCC的IOD值（49．076± 1．594）均为阳性，与5例正常皮肤组织的IOD值（15．859±0．975）比较差异有统计学意义（P＜0．05）。见图1。

2.2构建pLCE3C-GFP载体及鉴定

为进一步观察LCE3C在细胞定位，拟构建GFP融合表达载体。重组菌的PCR检测结果显示扩增出的目的片段约为280 bp。见图2A。重组载体经NheⅠ、XhoⅠ双酶切出现2个DNA片段，经过DL 15 000 DNA Marker比对，和pEGFP N1（4 700 bp）、目的片段LCE3C（285 bp）条带位置一致，重组载体送上海生工测序，序列与GenBank序列一致，证明载体构建成功。见图2B、2C。

2.3A431／LCE3C-GFP细胞系的构建

将A431细胞利用脂质体分别转染重组质粒pLCE3C-GFP和对照质粒pEGFPN1，转染24 h后，荧光显微镜下可观察到A431细胞，细胞轮廓清晰，荧光较强。通过G418筛选，得到单个细胞克隆。见图3。

2.4激光共聚焦显微镜实验检测LCE3C在A431／LCE3C-GFP细胞中的定位

激光共聚焦结果显示，对照组A431／GFP细胞绿色荧光分布于整个细胞。而在A431／LCE3C-GFP的细胞中，融合表达的LCE3C-GFP蛋白主要定位于ECM中。见图4。

2.5W estern b lot法检测LCE3C、GRHL3在HaCaT、A431、A431／GRHL3细胞中的表达

为探讨转录因子GRHL3在皮肤癌细胞中是否参与调控LCE3C基因的表达，拟利用实验室已经建立的过量表达GRHL3的细胞株，通过Western blot法分析GRHL3对LCE3C表达的影响。与HaCaT细胞比较，A431细胞中GRHL3表达量明显降低，与A431细胞比较，A431／GRHL3细胞中GRHL3表达量明显升高（F＝37．602，P＜0．05）；与HaCaT细胞比较，A431细胞中LCE3C表达量明显升高，与A431细胞比较，A431／GRHL3细胞中LCE3C表达量显著降低（F＝45．109，P＜0．05）。见图5。

3　讨论

SCC和BCC是一类非黑色素瘤皮肤癌，多发于头部、颈部、子宫以及肺部［6－7］，SCC和BCC在表皮分化的过程中会出现过度增殖与角化不完全的现象，类似于银屑病局部病理特征。LCE基因是位于人类1号染色体长臂近端的一个具有表皮分化复合物功能区的基因家族［8］。在表皮细胞分化的过程中这一功能区的基因均表达，如兜甲蛋白、外皮蛋白、丝聚合蛋白、富含脯氨酸的小分子量蛋白以及LCE［9－10］。根据氨基酸序列、基因结构以及表达方式的不同，可以将LCE家族分为LCE1～LCE6等6组，共18个成员。研究［11］表明银屑病组织标本的皮损部位LCE3表达升高；当正常皮肤发生表皮损伤时，LCE3表达增加［12］。在皮肤癌组织学方面，本研究显示，LCE3C在SCC和BCC组织中的表达量明显高于正常组织，主要分布在表皮的角质层；在细胞定位方面，本研究显示LCE3C主要分布于ECM；与HaCaT比较，LCE3C在人鳞癌细胞系A431中的表达也是明显增高，这和皮肤癌的免疫组化结果一致，提示LCE3C表达增加可能参与SCC和BCC的发生过程。LCE3C作为ECM的一种分泌蛋白，促进表皮损伤修复而协同参与形成表皮屏障。皮肤癌大都具有较强的局部侵袭能力，这种侵袭作用可能作为一种破坏表皮屏障的诱发因素，诱导LCE3C的表达以促进表皮的创伤修复。

GRH家族最早被发现参与调控果蝇上皮发育的过程，其中转录因子GRHL3是GRH家族的成员之一，在哺乳动物胚胎发育过程中，参与上皮细胞的迁移；而在成人表皮损伤后，GRHL3参与调控表皮的损伤修复过程［13］。Darido et al［14］证实GHRL3－／－小鼠在受到二甲基苯并蒽或佛波酯刺激后，较野生型小鼠更易发生皮肤癌。前期研究［15］显示，已经成功构建了肾小管上皮间质细胞转分化模型；通过过量表达GRHL3可以诱导上皮－间质细胞转分化，从而促进肿瘤的局部侵袭和远处转移；同时，Guardiola-Serrano etal［16］也在人乳腺癌细胞系中证实肿瘤坏死因子促进GRHL3的表达，并参与调控肿瘤细胞的迁移。这些研究提示GRHL3可能参与调控LCE3C的表达。细胞水平研究显示GRHL3在人SCC细胞系A431中的表达水平较HaCaT明显下降，同时LCE3C的表达增加；相反，在A431／GRHL3细胞系中，LCE3C的表达显著降低。这些结果提示LCE3C的表达可能与GRHL3的负调控有关，但其调控的分子机制有待进一步研究。

LCE3C作为皮肤表皮分化复合物的成分之一，分布于皮肤角质层的表皮ECM，参与表皮损伤的修复和表皮屏障的形成。在SCC、BCC等潜在的侵袭作用而导致表皮的局部损伤，可能诱发LCE3C的表达增加以促进局部损伤修复；LCE3C的表达改变可能受到转录因子GRHL3的负调控；这将为后续研究LCE3C在皮肤癌中的作用及其调控分子机制奠定基础。

参考文献

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中图分类号R 319；R 758．69

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1413－05

基金项目：国家自然科学基金（编号：81172591）

作者单位：1安徽医科大学生物化学与分子生物学教研室，合肥

作者简介：陈琼琼，女，硕士研究生；周海胜，男，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：haishengs＠ahmu．edu．cn后，微波热修复抗原，用3%H2O2除去内源性过氧化物酶，山羊血清封闭，4℃孵育一抗LCE3C （1∶100）过夜。第2天依次室温孵育生物素化通用二抗工作液、辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木精复染，最后组织经脱水透明后烘干封片。在400倍下，每张切片取3个视野拍照，并用Image pro plus 6．0图像分析系统测定图像中阳性反应部位的积分光密度（integral optical density，IOD）值。

The LCE3C expression in human skin cancers and the potential regulation m echanism s

Chen Qiongqiong，Tu Zhenzhen，Wang Rui，et al
（Dept of Biochemistry and Molecular Biology，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo investigate the LCE3C expresson in squamous cell carcinoma（SCC）and basal cell carcinoma（BCC），and the potentialmechanisms for regulating LCE3C expression．MethodsImmunohistochemical method was performed to detect the expression levels of LCE3C in the normal skin tissues or the lesion skin tissues from patientswith SCC and BCC．To find the cellular localization of the LCE3C proteins，human skin cancer cells were transfected by recombinant plasmid（pLCE3C-GFP）containing human LCE3C cDNA fused with the GFP，and then were observed under the confocal laser scanning microscopy．To further investigate the potentialmechanisms for regulating LCE3C expression in skin cancer，Western blot was used to detect the expression levels of GRHL3 and LCE3C in the skin cancer cells．ResultsImmunohistochemical analysis showed that the LCE3C highly expressed at the stratum corneum in the lesion skin tissues from patients with SCC and BCC，compared with the normal skin tissues．LCE3C proteins fused with GFP in A431 cells were mainly observed in extracellular matrix （ECM）based on the confocal laser scanning．Western blot analysis showed that the expression level of GRHL3 in the A431 cellswas reduced than that of the HaCaT cells；on the contrary，the expression level of LCE3C significantly increased in the A431 cells．Furthermore，LCE3C expression was also significantly decreased in the GRHL3 over-expressed cell（A431／GRHL3）compared with the A431 cells．ConclusionCompared to the normal skin tissues，LCE3C is dramatically expressed at the corneous layers in the skin cancer tissues．LCE3C proteins aremainly expressed in ECM，and might be negatively regulated by GRHL3 in A431 cells．

Key wordsLCE3C；squamous cell carcinoma；basal cell carcinoma；cellular localization