晋志远，黄　强，刘臣海，刘　振，林先盛，谢　放

m icroRNA-21对裸鼠人胆管癌细胞移植瘤EMT的影响

晋志远1，2，黄强1，刘臣海1，刘振1，2，林先盛1，谢放1

摘要目的观察microRNA-21（m iR-21）对裸鼠人胆管癌细胞移植瘤生长及上皮间质转化（EMT）进程的影响。

方法在两组裸鼠侧腹部皮下注射对数生长期的胆管癌细胞QBC939和稳定表达miR-21的QBC939-miR-21细胞，建立裸鼠移植瘤模型。采用Western blot、免疫组化及实时定量RTPCR法检测EMT的上皮细胞标志物E-钙粘蛋白（E-cadherin）和间质标志物N-钙粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的表达。结果QBC939-miR-21组移植瘤体积大于QBC939组（P＜0．05），且E-cadherin相对表达量降低，Vimentin、N-cadherin相对表达量增加。结论miR-21促进了裸鼠胆管癌细胞移植瘤生长和EMT进程，为进一步研究m iR-21在胆管癌中的功能及作用机制奠定了基础。

关键词胆管癌；microRNA-21；上皮间质转化；移植瘤

胆管癌是一种恶性度极高的起源于胆管上皮的肿瘤，手术切除率较低，术后复发率高，对于放、化疗不敏感，导致该疾病预后较差［1］。大多数胆管癌患者在确诊时已是晚期，术后肿瘤的复发率非常高，这往往与患者早期即发生肿瘤浸润转移有关。microRNA-21（miR-21）是miRNA大家族中一个具有多种功能也是研究较多的miRNA，其被发现在大量肿瘤中表达升高［2－3］。上皮间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）被认为和癌症的转移及复发息息相关，其重要特征之一是上皮细胞标志物E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达缺失和间质标志物波形蛋白（Vimentin）和N-钙黏蛋白（N-cadherin）表达升高。而miR-21可以通过诱导EMT进程而促进

2015－05－22接收

1　材料与方法

1．1材料

人胆管癌细胞QBC939由安徽医科大学附属省立医院肝胆胰外科安徽省重点实验室自行保存，慢病毒表达载体构建稳定表达miR-21的胆管癌细胞QBC939-miR-21及空白对照组QBC-NC在前期实验后冻存保存；SPF级BALB／C 4～5周龄雌性裸鼠16只，15～20 g，购自上海实验动物中心；RNA抽提试剂盒购自德国Qiagen公司；DMEM培养基、胎牛血清及青、链霉素购自美国Hyclone公司；E-caherin、N-cadherin及Vimentin抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；逆转录试剂盒、PCR试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1．2方法

1．2．1实时定量RT-PCR检测miR-21表达

收集各组细胞，常规培养、传代，取对数生长期的细胞检测miR-21的表达。按照TRIzol法抽提总RNA，以U6为内参，Primer 5．0分别设计引物，U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游 引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-21上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTTATCAGACTGATG-3′，下游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′，按照逆转录及PCR试剂盒说明设置反应体系及参数，进行PCR扩增。所得数据经内参基因均一处理，通过2－ΔΔCt方式计算目标基因表达差异以倍数表示。

1．2．2裸鼠皮下移植瘤模型的建立

胆管癌细胞QBC939及QBC939-miR-21细胞分别于16只裸鼠两侧背部皮靠后下接种，约0．1 ml／只，接种后待肉眼能观察到肿瘤时开始用微米卡尺测肿瘤体积。于第4周末处死全部裸鼠，剥离移植瘤称重；肿瘤体积按以下公式计算：肿瘤体积（mm3）＝0．5×长径（mm）×短径2（mm2）。

1．2．3免疫组化检查瘤体部分组织

获得瘤体后一部分于液氮中冻存，另一部分用4%多聚甲醛固定，切取合适大小材料（厚度约0．2 cm）进行包埋，乙醇及二甲苯溶液脱水，石蜡包埋后的标本在二甲苯溶液脱蜡，逐层梯度酒精和蒸馏水水化，柠檬酸盐缓冲液（pH＝6．0）处理后行抗原修复，正常山羊血清封闭处理15 min，用一抗4℃处理过夜，相应二抗和DAB显色处理，苏木精复染、脱水、封片。E-cadherin主要在肿瘤细胞的细胞膜中表达染色，≥90%为正常表达，＜90%为缺失表达［5］。N-cadherin、Vimentin等主要在肿瘤细胞的细胞质中表达染色，≥20%为阳性表达，否则相反［6］。标本均经由两名病理医师证实。

1．2．4实时定量RT-PCR法检测EMT相关蛋白的相对表达量

液氮罐中取出组织，运用TRizol法提取总RNA，以GAPDH作为内参基因，以Primer 5．0分别设计引物，按照逆转录及PCR试剂盒说明设置反应体系及参数，进行逆转录合成cDNA和PCR扩增。内参片段 GAPDH为299 bp，目的片段E-cadherin为94 bp，N-cadherin为201 bp，Vimentin为278 bp。所得数据处理同1．2．1。

1．2．5Western blot法检测EMT相关蛋白表达

将各组40 mg组织块尽量剪碎，加RIPA裂解液（含PMSF和Cocktail）于匀浆器中，然后将裂解液于4℃、14 000 r／min离心10 min，获得总蛋白后4℃过夜，Lowry法蛋白定量，紫外分光光度计测量组织蛋白浓度后将蛋白浓度调至5μg／μl，再经PAGE电泳将蛋白电转至PVDF膜上；5%脱脂奶粉封闭30min后，分别加入各目标蛋白一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（1∶2 000）反应、孵育，利用 X光胶片曝光、显影、定影、拍照，用Image J软件进行条带灰度分析。以GAPDH作为对照，目的蛋白的灰度值／对照GAPDH灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。

1．3统计学处理

应用SPSS 17．0软件进行分析，两组计量资料采用t检验，多组计量资料分析采用方差分析。

2　结果

2.1实时定量 RT-PCR检测 m iR-21在各细胞组的表达

分别收集QBC939-miR-21组、QBC939-NC组及QBC939组细胞抽提RNA，检测miR-21的相对表达量。结果显示QBC939-miR-21组 miR-21表达量（32．27±1．05），较 QBC939-NC组（1．00±0．01）及QBC939组（0．75±0．01）高，差异有统计学意义（F＝18．32，P＜0．01），而QBC939-NC组与QBC939组差异无统计学意义。见图1。

2.2m iR-21对裸鼠皮下胆管癌移植瘤生长的影响

每天测量移植瘤体积，绘制肿瘤生长曲线（图2）。结果显示，QBC939-miR-21组肿瘤的增长速度明显比QBC939组肿瘤的增长速度快，其中QBC939组有1只小鼠始终未成瘤。于第4周末剥离移植瘤后称重（图3），组织的一部分于－80℃冻存，另一部分于4%多聚甲醛固定。QBC939-miR-21组移植瘤重为（0．50±0．23）g，QBC939组重量为（0．23± 0．11）g，两组移植瘤重量差异有统计学意义（t＝2．85，P＜0．05），见图4，miR-21在小鼠体内可明显促进肿瘤组织的增殖与生长。

2.3免疫组化法检测两组移植瘤E-cadherin、N-cadherin、Vim entin蛋白表达

免疫组化法检测两组裸鼠皮下移植瘤E-cadherin缺失率及N-cadherin 和Vimentin阳性表达率，QBC939组与QBC939-miRNA-21组E-cadherin缺失率、N-cadherin阳性表达率及Vimentin阳性表达率分别为57．1%（4／7）vs 75．0%（6／8）、71．4%（5／7）vs 87．5%（7／8）、57．1%（4／7）vs75．0%（6／8）。结果证实miR-21的上调表达能够降低E-cadherin的表达，增加 N-cadherin及Vimentin表达（图5）。

2.4实时定量RT-PCR检测两组移植瘤E-cadherin、N-cadherin、Vim entin m RNA表达量

实时定量RT-PCR检测QBC939组与QBC939-miR-21组E-cadherin、N-cadherin及Vimentin mRNA相对表达量。结果提示 QB939-miR-21组较 QBC939组裸鼠皮下移植瘤E-cadherin表达降低，N-cadherin及Vimentin表达增高。见图6。

2.5W estern blot法检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋白表达量

Western blot法检测QBC939组与 QBC939-miR-21组E-cadherin蛋白表达量（2．02±0．79 vs0．34±0．08），差异有统计学意义（t ＝5．2，P＜0．01），N-cadherin蛋白表达量（0．20± 0．05 vs 0．87±0．42），差异有统计学意义（t＝－4．012，P＜0．05），Vimentin蛋白表达量（0．32±0．17 vs1．16±0．58），差异有统计学意义（t＝－3．429，P ＜0．05）。结果表明，QB939-miR-21组较QBC939组裸鼠皮下移植瘤E-cadherin表达降低，N-cadherin及Vimentin表达增高。见图7。

3　讨论

microRNA是一类通过与靶mRNA的3′非翻译区互补结合，引起靶基因的抑制翻译或降解的内源性非编码小分子RNA。miR-21作为microRNA家族中被较早发现的成员之一，其编码基因位于17q23．1染色体上，与跨膜蛋白49（TMEM49）基因重叠［7］。研究［8－9］证实miR-21在多种恶性肿瘤中处于高表达水平，如肝癌、结直肠癌、胃癌、乳癌等，并能显著提高肿瘤的生长及侵袭转移能力，在肿瘤的进展及评估预后中发挥重要作用。本试验中通过慢病毒表达载体的构建成功的上调了QBC939细胞中miR-21的表达，通过小鼠的皮下移植瘤模型构建，显示转染后的QBC939细胞形成的皮下移植瘤较对照组，生长速度及重量都明显加强，提示miR-21在胆管癌中也发挥着促癌基因的作用，能促进肿瘤细胞的生长。

胆管癌的侵袭与转移通常是影响术后患者生存率的主要因素之一，而近年来越来越多的证据［10］表明，EMT现象是肿瘤细胞发生侵袭与转移的机制之一。EMT是指上皮细胞向间质细胞转化的过程，是胚胎发育过程中的一种生理现象，也是肿瘤细胞具有迁移性和侵袭性的一个主要原因。其细胞表型发生改变，以E-cadherin表达缺失和N-cadherin、Vimentin阳性表达为EMT现象的标志［11］。大量的miRNA被发现能直接或间接的参与EMT进程的调控，其中以miR-200以及miR-34家族研究［12］较多。本团队前期研究［13］显示miR-21在胆管癌组织中表达较癌旁组织及正常组织都高，体外实验［4］也证实了miR-21在胆管癌细胞中可以通过诱导EMT进程促进胆管癌细胞的侵袭与转移。本研究利用免疫组化、Western blot、qRT-PCR法对皮下移植瘤组织的检测显示，上调表达 miR-21的 QBC939细胞其构建移植瘤组织较空白对照组小鼠移植瘤组织中E-cadherin表达减低，N-cadherin及Vimentin表达增强。以上均表明miR-21能够通过调节EMT相关分子的表达从而诱导EMT进程，也进一步证实了miR-21能够通过促进EMT进程从而影响胆管癌的侵袭与转移。

参与诱导或调控EMT进程的因素十分复杂，其被大量的细胞的信号所调节并最终激活转录因子，如Twist，Snail及Zeb等。Bao et al［14］在肝癌中发现miR-21能通过调节PTEN和hSulf-1介导的AKT和ERK信号通路诱导EMT的发生，而Bin et al［15］发现在胰腺癌中Notch-1信号通路或许介导了miR-21诱导EMT进程的发生，而在胆管癌中miR-21通过何种信号通路诱导EMT的发生还需进一步研究，本团队下一步将就这一现象利用基因芯片的技术进行更深入的探讨，进而为胆管癌的诊断以及靶向治疗提供更为切实可靠的理论依据。

参考文献

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中图分类号R 73-37

文献标志码A

文章编号1000－1492（2015）10－1399－05

基金项目：国家自然科学基金（编号：81272397）；安徽省自然科学基金（编号：1208085MH176）

作者单位：安徽医科大学附属省立医院1普通外科、2肝胆胰外科安徽省重点实验室，合肥230001

作者简介：晋志远，男，硕士研究生；黄强，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：hq-sohu＠．com胆管癌的侵袭转移能力［4］，该研究进一步用体内实验证实miR-21与EMT在胆管癌中的关系。

Effect ofm icroRNA-21 on EMT of human cholangiocarcinoma xenografts in nudem ice

Jin Zhiyuan1，2，Huang Qiang1，Liu Chenhai1，et al
（1Dept of General Surgery，2Key Laboratory of Hepatopancreatobiliary Surgery of Anhui Province，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo observe the effects ofmicroRNA-21（miR-21）on the epithelial-mesenchymal transition （EMT）of human cholangiocarcinoma xenografts in nude mice．MethodsQBC-939 and QBC939-miR-21 cholangiocarcinoma cellswere subcutaneously injected into two groups of nudemice respectively as xenografts，expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin were detected by Western blot，RT-PCR and immunohistochemical analysis．ResultsCompared with group QBC939，group QBC939-miR-21 xenografts showed the greater tumor weight and rapider growth，expression of E-cadherin decreased，whereas the protein expressions of Vimentin and N-cadherin increased．ConclusionmiR-21 overexpression enhances tumor growth，which promotes EMT phenotype and the foundation for further study ofmiR-21 function in cholangiocarcinoma andmechanism is established．

Key wordscholangiocarcinoma；microRNA-21；EMT；xenograft