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(1.西华大学生物工程学院，四川 成都 610039；2.成都大帝汉克生物科技有限公司，四川成都 611130)

·生物工程·

乳脂酶酶解无水奶油制备天然奶味香精

何 洋1，包清彬1*，杨 洋1，赵华修2

(1.西华大学生物工程学院，四川 成都 610039；2.成都大帝汉克生物科技有限公司，四川成都 611130)

以开发具有发酵乳脂味、并伴有一定奶油香的天然奶味香精为目的，筛选酶品种和酶解底物，研究酶解时间、酶解温度、pH、酶添加量、底物浓度对乳脂酶酶解无水奶油制备天然奶味香精的影响。以感官评分作为主要评定指标，酸价作为参考，在单因素实验的基础上，采用正交实验分析与优化。结果表明：在酶解时间6 h、酶解温度50 ℃、pH6、乳脂肪酶添加量2.5%、底物质量分数85%条件下所得的奶味香精，具有较浓郁的发酵乳脂味和一定的奶油香气，香气柔和、协调性较好。

乳脂酶；无水奶油；酸价；感官评分；奶味香精

奶味香精是使用最广泛的食品用香精之一，在食品和饲料工业中都得到广泛应用。目前最常用的奶味香精，多以香兰素、乙基香兰素、内酯等合成原料进行调配，往往具有一定的刺激性，存在缺乏天然感、愉悦度欠佳、留香时间短等缺点[1]；因此，开发天然、安全的奶味香精，是人们一直致力研究的课题。天然奶香香气物质组分一般包括醇类、醛类、酸类、酮类、酯类、内酯、硫化物等，其香气来源一是鲜奶中的天然香气成分，二是乳品加工中形成的香气成分，主要包括双乙酰(2，3-丁二酮)、乙偶姻、丁位癸内酯、丁位十二内酯和牛奶内酯等[2]。近年来有研究[3]表明，利用酶解技术酶法水解奶油(或稀奶油)是制备天然奶味香精的有效途径，在一定条件下对奶油进行酶法水解，产生具有奶香味特征的化合物，可以使酶解底物增香150～250倍。

从市售的不同厂家生产的酶解奶油产品看，由于各自使用的酶不同，工艺条件不同，产品品质、香气差异较大，有的偏重奶脂味，有的偏重奶油香味，有的更具发酵奶味；因此，以酶解奶油生产天然奶味香精的工艺及条件，仍有根据产品需求等，深入研究的必要。

本研究重点开发一种具有发酵乳脂味为主体香并伴有一定奶油香味的天然奶味香精。为此，需要优选适合的乳脂酶和酶解底物，确定香精的评定标准，在此基础上，采用单因素试验考察影响酶解的主要因素酶解温度、酶解时间、pH、酶添加量、底物浓度对奶味香精品质的影响，再以正交实验对工艺条件进行优化。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

无水奶油：新西兰原装进口奶油(市售)； 稀奶油：市售；乳脂酶1(脂分解能力相对较强，脂合成及脂交换能力相对较弱)：苏柯汉(潍坊)生物工程有限公司生产；乳脂酶2(脂合成及脂交换能力相对较强，脂分解能力相对较弱)：成都大帝汉克生物科技有限公司提供；电子天平：赛多利斯科学仪器(北京)有限公司生产；数显恒温水浴锅：HH-S4，金坛市医疗仪器长生产；恒温振荡器：SHA-B，金坛市富华仪器有限公司；乙醇、乙醚、KOH(均为分析纯)，成都科龙试剂生产；蒸馏水：西华大学实验室提供。

1.2酶解工艺

奶油→溶化→加水(调底物浓度)→乳化均质→巴氏杀菌→降温→调pH→添加乳脂酶→酶解→灭酶→酶解产物。

1.3奶味香精感官评价标准

以通过专业评香师筛选的市售奶油香精作为对照，选择10位感官评定人员进行感官评价。评定指标主要由A奶香味香气、浓度和愉悦度、B奶味柔和度及协调性、C异味浓度3个方面组成，每1个评定项目满分均为10分。评定者根据表1对评定项目打分，将A、B、C项目分数叠加并求平均值为该样品得分。

表1 感官评分标准

1.4酸价的测定

检测所得酶解奶味香精酸价，可了解酶解程度与奶味香精感官品质的关系，为品质控制提供参考。参考GB/T 5530—2005，以中和1 g酶解物中的游离脂肪酸所需氢氧化钾的质量(以mg)表示其酸价[4]，计算公式为

(1)

式中：V为所用KOH标准溶液的体积，mL；c为KOH溶液浓度，moL/L；m为样品的质量，g；56.1为KOH的摩尔质量，mg/moL。

2 结果与讨论

2.1单因素实验分析结果

2.1.1 乳脂酶筛选

乳脂酶一般包含微生物乳脂酶、天然乳脂酶、人工合成乳脂酶。不同乳脂酶活性不同且大多具有专一性，为将奶油中的某中不带香味的脂肪酸专一性酶解成带有特殊奶香味的短链脂肪酸，以获得预期的奶香味，需对不同种类乳脂酶进行挑选优化。在相关前期粗选实验基础上，本实验比较了2种乳脂酶的酶解效果，实验结果如图1所示。乳脂酶1(苏柯汉(潍坊)生物工程有限公司生产)酶解程度及感官评分相对较高，为此，本实验选用乳脂酶1(苏柯汉(潍坊)生物工程有限公司生产)作为实验供体酶。

图1 乳脂酶对酶解反应的影响

2.1.2 底物对奶油酶解增香的影响

选择无水奶油、稀奶油作为酶解底物，在酶解温度50 ℃、酶添加量2.5%、底物质量分数85%、pH 6的条件下进行酶解。以2 h为时间单位对酶解产物进行感官评分及酸价测定，实验结果如图2所示。

图2 底物对酶解反应的影响

由图2可知随着时间的增加无水奶油、稀奶油感官评分及酸价总体呈上升趋势，但无水奶油感官评分远高于稀奶油，5 h后表现得更为明显。其原因可能是乳脂酶活性的保持仅需极少量的水保持酶的活性分子构象；因此只要能够满足保持乳脂酶活性分子构象的水量，感官评分以及酸价就会随着底物质量分数的增高而增高[5]。因此选择无水奶油作为酶解底物较为合适。

2.1.3 底物浓度对酶解增香的影响

乳脂酶只能作用于油水界面上，大多数乳脂酶的活性中心是由丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸组成的三联体[6]。脂肪酸包含疏水头和亲水尾(极性氨基酸或带电荷的氨基酸残基或碳水化合物)2部分组成，酶的活性中心与疏水头的位置不同，但很靠近，疏水头保证酶在底物上的定位；亲水尾使酶分子在界面上的定向更为稳定，因此酶在油水界面上具有较大的活性[7]。乳脂酶对底物的催化作用需要少量水分以维持酶分子构象，使其酶分子活性位点最好地与底物分子结合并达到最好的催化效果。为此，设定酶解温度50 ℃、时间6 h、酶添加量2.5%、pH 6，并选择75%、80%、85%、90%、95%、100%(无水奶油含量)作为质量分数梯度变化值，考察底物质量分数对乳脂酶酶解奶油的影响。

图3 底物质量分数对酶解反应感官评分的影响

图4 底物质量分数对酶解反应酸价的影响

实验结果如图3、4所示，随着时间的增加底物质量分数不同的样品感官评分及酸价都呈上升趋势，但是感官评分在6 h后有所下降。由横向及纵向比较可知，底物质量分数为85%的样品感官评分一直高于其他质量分数梯度，且6 h达到峰值。此时反应体系中少量的水恰好维持酶的活性分子构象，反应体系中水分含量超过85%底物质量分数中的水分时，体系中的水分会影响感官品质，因此85%为适合的质量分数。

2.1.4 酶添加量对酶解增香的影响

设定酶解温度50 ℃、pH6、底物质量分数85%，考察乳脂酶不同添加量对感官评分及酸价的影响。

图5 酶添加量对酶解反应感官评分的影响

图6 酶添加量对酶解反应酸价的影响

图5、6可见，随着酶解时间及乳脂酶用量的增加，感官评分及酸价也随之增加。酶添加量由0.5%增加到2.5%时感官评分逐渐上升，酶添加量大于2.5%时感官评分呈现一定程度的下降。此外，酸价在2～6 h增长较快，6 h后趋于平缓。由此可见，酶添加量2.5%、酶解时间6 h酶解产物奶香成分含量达到峰值，继续增加酶用量并不利于酶解产物中奶香成分的增加，因此，2.5%的酶用量为较适合的酶添加量。

2.1.5 pH值对酶解增香的影响

乳脂酶分子活性中心对底物起催化作用的分子集团受pH的影响较大，在设定底物质量分数85%、酶解温度50 ℃、酶添加量2.5%的条件下，探讨不同pH值对底物酶解反应的影响。

图7 pH对酶解反应酸价的影响

图8 pH对酶解反应感官评分的影响

由图7、8表明，pH值为8、9、10时乳脂酶可能部分失活导致感官评分及酸价较低。pH值为5、6、7时，随着时间增加感官评分及酸价逐渐上升，2～6 h感官评分及酸价上升趋势明显，6 h后感官评分有所下降，酸价趋于平缓。由此可见，pH为6是酶解反应较适合的pH值。

2.1.6 温度对酶解增香的影响

酶解温度对底物状态及乳脂酶活性、分子构象等具有较明显影响，为此，在固定底物质量分数85%、酶添加量2.5%、pH6的条件下，设定酶解温度为30 、40、50、60、70、80 ℃，考察温度对酶解反应的影响。

图9 温度对酶解反应感官评分的影响

图10 温度对酶解反应酸价的影响

实验结果如图9、10所示，在30～60 ℃、2～6 h范围内进行酶解，感官评分及酸价都在上升，其中50 ℃实验组感官评分相对较高，6 h后变缓，酸价也呈现出相同的变化趋势。70 、80 ℃实验组，随时间变化酸价变化不明显，感官分值较低，其原因可能是酶活性中心遭到破坏导致酶失活。由此可见，50 ℃是较适合的酶解温度。

2.2正交实验对酶解奶油增香条件的优化

根据单因素实验结果，采用正交实验对影响酶解反应的主要因素进行优化，采用5因素4水平实验设计，以L16(45)正交表，因素水平见表2，正交实验结果见表3。

表2 L16正交水平表

由表3可以看出，影响酶解物感官品质的主次因素为A =C > D> B > E，即底物质量分数=pH>温度>酶添加量>酶解时间。最佳的工艺条件为A2B3C2D2E2,即底物质量分数85%、酶添加量2.5%、pH6、温度50 ℃、酶解时间6 h。

在上述最佳酶解条件下，进行3次验证实验，所得酶解奶味香精感官评定平均分值为7.58，酶解奶油酸价值为63.65 mg/g，酶解奶味香精发酵乳脂味香气浓郁，愉悦度好。经专业评香师评定，所得酶解奶味香精具有较强的天然发酵乳脂味并伴有一定的奶油香，香气、香韵协调性好，天然感强，达到了项目设定要求。

3 结论

利用乳脂酶酶解奶油开发一种发酵乳脂味为主体香并伴有一定奶油香的天然奶味香精，以感官评定为主要考察指标，酸价为辅助考察指标，通过单因素及正交实验，得到无水奶油是适合的酶解底物，最佳工艺条件为底物质量分数85%、温度50 ℃、pH6、酶解时间6 h、酶添加量2.5%，该工艺条件下制得的酶解物具有较浓厚的发酵乳脂味并伴有一定奶油香，香气浓郁、醇厚，香气协调性好。

[1]孔凌，刘超，喻麟，等.酶解奶油增香物制备工艺及其在奶香饲料调味剂中的应用[J].饲料工业，2012(4):22-25.

[2]胡文效，姜兴涛.乳类食品香成分及其成因[J].山东食品发酵，2001(4):36-48.

[3]武彦文，欧阳杰，张津凤，等.酶法水解奶油制备奶昧香精的研究[J].中国调味品，2003(4):39-42.

[4]宁正祥.食品成分分析手册[M].北京:中国轻工业出版社,1998.

[5]王蓓，曹雁平，郑福平，等.酶法制备天然牛奶香精的工艺条件与应用研究[J].食品工业科技，2012(4):262-265.

[6]Schrag J D,Yunge L I,Shah W U,eta1.A Ser-His· Glu triad form the catalytic site of the lipase from Geotrichum Caladium [J]. Nature,1991,351:761-764.

[7]王蓓.酶法制备天然牛奶风味基料及牛奶香精的研究[D].无锡：江南大学,2009.

(编校：叶超)

StudyonHydrolysisofAnhydrousMilkFatbyMilkLipaseforNaturalFlavoringAgent

HE Yang1,BAO Qing-bin1*,YANG Yang1,ZHAO Hua-xiu2

(1.BioengineeringCollege,XiHuaUniversity,Chengdu610039China;2.ChengduGreatHankbiologicalLtd,Chengdu611130China))

The effect of hydrolysis time, hydrolysis temperature, pH, concentration of substrate on active hydrolysis of Anhydrous Milk Fat by milk lipase for natural flavoring agent as well as screening types of enzymes and enzymatic substrate were investigated. On the other hand the sensory evaluation as the major index. Hydrolysis of Anhydrous Milk Fat in different condition was researched, and orthogonal experiment anlysis and optimization were utilized.. Experiment results show that the conditions as followed: hydrolysis time 6h, the concentration of the substrate 85%, temperature 50℃, pH=6,addition amount of milk lipase 2.5%，are the best experimental design.

lipase; anhydrous milk fat; acid value; sensory evaluation; milk flavor

2014-05-28

教育部春晖计划项目(Z2012018)

：包清彬(1962—)，男，教授，主要研究方向为食品科学与粮食工程。E-mail:bao717@126.com

TS202.3

：A

：1673-159X(2015)02-0098-5

10.3969/j.issn.1673-159X.2015.02.020

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