张君诚,陈作毅,宋育红,2

(1.福建省资源环境监测与可持续经营利用重点实验室,福建 三明 365004; 2.复旦大学三明学院天然药物工程研究中心,福建 三明 365004)



石杉碱甲生物合成与代谢调控关键基因的差异表达分析

张君诚1,2Δ,陈作毅1,宋育红1,2

(1.福建省资源环境监测与可持续经营利用重点实验室,福建 三明 365004; 2.复旦大学三明学院天然药物工程研究中心,福建 三明 365004)

目的 选择并比较L-赖氨酸脱羧酶、CYP450(CYP450-71A1和CYP450-72A1)、加双氧酶、N-甲基转移酶等石杉碱生物合成途径可能的关键基因(酶)在华南马尾杉(Phlegariurus austrosinicus(ching)L.B.Zhang)和有柄马尾杉(Phlegariurus petiolatus (C.B.Clarke) H.S.Kung et L.B.Zhang)中差异表达的情况。方法 以相同生境但石杉碱甲含量差异明显的一对石杉科马尾杉属植物华南马尾杉与有柄马尾杉为试材，提取总RNA并进行总RNA的反转录，根据文献分别设计引物，开展荧光定量PCR实验并对2者的差异表达结果进行分析。结果 加双氧酶基因在高含量石杉碱甲的有柄马尾杉中表达，但在华南马尾杉中表达量极低或者不表达；在有柄马尾杉植体中相对高表达的基因有L-赖氨酸脱羧酶基因(约180倍)，CYP450-71A1基因(约33倍)，CYP450-72A1基因(约223倍)；N-甲基转移酶基因在2种材料中表达量接近。结论 加双氧酶基因极有可能编码石杉碱生物合成限速酶和关键酶，导致2种植物中石杉碱甲的含量明显差异；L-赖氨酸脱羧酶基因、CYP450-71A1基因、CYP450-72A1基因编码的蛋白对石杉碱甲的积累具有促进作用；N-甲基转移酶基因应是编码定位于石杉碱生物合成途径下游石杉碱与石杉碱甲之间转换的催化酶，但非关键限速酶。

石杉碱甲；生物合成；基因；荧光定量PCR

石杉碱甲(Huperzine A, Hup A)作为一种强效、低毒且高选择性的中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂，在中老年痴呆等疾病的治疗价值日益凸显。由于石杉碱甲在生长缓慢且生物量很低的天然石杉植物全草中含量甚微，故野生资源压力巨大，无法满足市场需求[1]。石杉碱甲开环的吡啶酮环和六氢吡啶环结构的复杂性，使其人工合成的成本远高于植物提取[2]，且目前已合成的一百多个石杉碱甲类似物的抑酶活性大多明显不如天然石杉碱甲[3]。

近年来生物合成与代谢工程已成为提高植物次生代谢物产量的潜在途径之一。目前认为石杉碱甲生物合成的起始物为L-赖氨酸[4]，它被L-赖氨酸脱羧酶催化脱羧形成1，5-戊二胺，1，5-戊二胺脱去NH2形成1-哌啶烯，后者与丙酮二碳酸或Malonyl-CoA形成石榴碱；石榴碱和4PAA/4PAACoA脱羧形成Phlegmarine，Phlegmarine在CYP450催化下，形成石松定碱骨架(Lycodane，石杉碱甲的前体物质)，再经过一系列的氧化开环、脱甲基以及甲基化(N-甲基转移酶催化)，最终形成石杉碱甲[5]。目前关于石杉碱甲生物合成与代谢途径的关键基因的研究报道较少，仅见Luo[6-7]通过RT-PCR技术筛选出了蛇足石杉(Huperzia serrata)的CYP450基因，并认为该基因参与石杉碱甲形成的报道。

在石杉植物野外生态及植物化学工作中，研究发现在同一生境下的同为石杉科马尾杉属植物的华南马尾杉与有柄马尾杉2者之间石杉碱甲含量甚异，后者几近为前者的10倍[8]。这为石杉碱代谢途径关键基因的差异研究提供了一对良好的实验材料，在前述认识基础上，选择并定量比较L-赖氨酸脱羧酶、CYP450(CYP450-71A1和CYP450- 72A1)、加双氧酶、N-甲基转移酶等可能的关键基因(酶)在2种材料中差异表达的情况，对于揭示石杉碱的生物合成与代谢调控路径与机制应该具有重要的价值。

1 材料与方法

1.1 植物材料 实验材料华南马尾杉(Phlegariurus austrosinicus(ching)L.B.Zhang)、有柄马尾杉(Phlegariurus petiolatus (C.B.Clarke)H.S.Kung et L.B.Zhang)的新鲜茎叶，由项目组于2012年秋季采集于福建省尤溪县高山村的福建省石杉科植物种质资源圃。植物材料由复旦大学潘胜利教授与本文作者鉴定。

1.2 试剂与仪器设备 GoTaq(R) qPCR Master Mix试剂盒(Promega公司)；TRIzon Reagent CW0580A(康为世纪公司)；M-MLV M1701(Promega)；RNasin N2511(Promega公司)；常用分子生物学实验试剂自配。实时荧光定量PCR仪QP4811型(百泰克)，自动凝胶图像分析仪JS-380A(上海培清科技公司)，凝胶成像仪GIS 2008(上海天能公司)。

1.3 总RNA的提取与总RNA反转录 RNA提取按康为世纪TRIzon Reagent(CW0580A)说明书方法进行；总RNA的反转录使用Promega M-MLV反转录酶进行体外反转录实验，方法按其说明书进行。

1.4 荧光定量PCR引物设计

1.4.1 引物设计：根据NCBI蛇足石杉(Huperzia serrata)EST数据库序列GenBank: GO912417.1，被注释为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的序列[9],选定该系列为每场基因。另外，EST数据库序列GenBank: GO914645.1，被注释为编码L-赖氨酸脱羧酶的蛇足石杉mRNA序列；GenBank: GO914428.1，GO913165.1，GO911852.1被注释为CYP450；GenBank: GO912724.1被注释为加双氧酶；GenBank: GO913407.1被注释为N-甲基转移酶。结合使用primer premier 5.0，oligo 6.0等软件设计引物，由博尚生物技术有限公司合成。见表1。

表1 关键酶基因荧光定量PCR引物设计

1.4.2 荧光定量分析：室温配制PCR反应混合液20 μL，其中cDNA模板2.0 μL，上游引物(10 μM)0.4 μL，下游引物(10 μM)0.4 μL，2×GoTaq® qPCR Master Mix, 10 μL ，Nuclease-Free Water 7.2 μL，分至各反应管，加入2 μL模板或Nuclease-Free Water(阴性对照)。轻微离心并去除8联管中反应物的气泡；采用三步法进行实时荧光定量PCR：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 45 s，40个循环。温度降至4 ℃，后继续加热进行溶解曲线测定；50 ℃～90 ℃，每隔1 ℃持续测定荧光信号10 s。结果通过百泰克荧光定量PCR双通道软件系监测分析。

2 结果

根据荧光定量PCR结果数值，使用内参基因的Ct值归一化目的基因的Ct值，计算ΔCt，ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(GAPDH)；用华南马尾杉的关键酶基因ΔCt值归一化有柄马尾杉的ΔCt值。按照Livak等[10]方法计算ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt(有柄马尾杉)-ΔCt(华南马尾杉)； 计算相对于对照组的表达水平比率，求2-ΔΔCT。见表2。

表2 荧光数据分析

由表2得知：①华南马尾杉L-赖氨酸脱羧酶基因的Ct值为18.98333，而有柄马尾杉中该基因的Ct值为18.94333，通过归一化方法可知有柄马尾杉中该基因表达量远远胜过华南马尾杉(约180倍)；②华南马尾杉中CYP450 71A1基因的Ct值为30.11，有柄马尾杉该基因的Ct值为32.52，通过归一化方法可知有柄马尾杉中该基因表达量为华南马尾杉的33倍；③华南马尾杉CYP450 72A1基因的Ct值为18.73333，有柄马尾杉该基因的Ct值为：18.39，GAPDH基因的的Ct值为：31.89。通过归一化方法可知有柄马尾杉中该基因表达量为华南马尾杉的223倍。④华南马尾杉加双氧酶基因的Ct值平均超过38，GAPDH基因的的Ct值为：24.42667；有柄马尾杉加双氧酶基因的Ct值为：30.03，GAPDH基因的的Ct值为：31.89。通过归一化方法可知加双氧酶基因在有柄马尾杉中有表达，该基因在华南马尾杉暂无检测到克隆，因此，可以认为该酶在华南马尾杉中表达量极低或者不表达。⑤华南马尾杉N-甲基转移酶基因的Ct值为19.26333，GAPDH基因的的Ct值为：25.47；有柄马尾杉加双氧酶基因的Ct值为：19.27333，GAPDH基因的的Ct值为：25.76667。通过归一化方法可知有柄马尾杉中N-甲基转移酶基因表达量约为华南马尾杉的0.8倍。

根据荧光数据分析得到的结果，制成各关键酶基因表达差异倍数图，更加具体形象的反映了关键酶基因差异表达，见图1。

图1 各关键酶基因表达差异倍数图Fig.1 The key genes differential expression

图1中灰色柱状图(上)表示华南马尾杉关键酶基因表达情况，白色柱状图(下)表示有柄马尾杉关键酶基因表达情况。经归一化后，除了加双氧酶基因无表达为“0”外，其余基因均被修正为“1”。特别说明：浅色透明为有柄马尾杉加双氧酶表达量，经2-ΔΔCT计算后相对华南马尾杉其表达量倍数为无穷大。

同时，对各关键酶基因qRT-PCR产物进行电泳定性分析，见图2。图中左半部分为内参基因GAPDH表达凝胶电泳图，右半部分为关键目的基因表达凝胶电泳图。图2至少直观地显示Group 4的加双氧酶基因再两种马尾杉中的表达差异十分明显，该基因在华南马尾杉中几乎看不到扩增条带。凝胶电泳图直观结果与荧光定量PCR数据基本吻合。

图2 各关键酶基因表达差异电泳图Group1：L-赖氨酸脱羧酶基因差异表达；Group 2：细胞色素P450-72A1基因差异表达；Group 3：细胞色素P450-71A1基因差异表达；Group 4：加双氧酶基因差异表达；Group 5：N-甲基转移酶基因差异表达Fig.2 Electrophoresis of the differentially expressed key genes Group1: differential expression of l-lysine tryptophan decarboxylase gene；Group 2:differential expression of cytochrom P450-72A1 gene；Group 3:differential expression of cytochrome P450-71A1；Group 4:differential expression dioxygenase gene;Group 5:differential expression of N-methyltransferase gene

3 讨论

石杉碱甲的天然来源不足与其衍生物ZT-1的药源需求矛盾十分突出。有关药源植物(石杉)组织培养研究[11]、产石杉碱甲内生真菌发酵培养[12]、石杉碱甲全合成、类似物或衍生物合成[2-3]等寻找更多的石杉碱甲来源的研究时有报道，但都难以达到替代药源的效果。目前石杉碱甲主要还是来源于生长缓慢且资源日渐稀少的石杉科天然植物。喜树碱(吲哚生物碱)等生物合成与代谢研究为植物重要次生代谢物的生物合成与代谢工程研究提供了很好的思路[13]。当然，开展这方面工作，对合成与代谢途径中的关键(限速)酶的了解与研究就显得十分重要。有报道已获得部分蛇足石杉的转录组信息，从中发现了可能参与蛇足生物碱、三萜合成的转录本，并从中发掘了可能参与石杉碱甲、三萜化合物等化合物的生物合成的CYP450[6-7]、HsCAS1[14]和鲨烯合酶 HsSQS1[9]等基因，为石杉植物重要次生代谢物的生物合成途径研究提供了一些基础。

姬生国等[15]使用石杉碱甲含量几乎为零的东北石杉(Huperzia miyoshiana (Makino) Ching)与含量高的伏贴石杉(Huperzia selago (Linn.) Bernh.ex shrank et Mart.var.appressa (Desv.) Ching)做为一组试材并进行差异表达蛋白筛选，发现一种只存在于伏贴石杉中的丝裂素调节蛋白(Mrp3)，该蛋白被证实是一种具有促使烟草分泌次生代谢物香紫苏醇作用的与ATP结合的卡盒型转运蛋白[16]。与他们工作思路类似，本研究通过荧光定量分析石杉碱甲含量明显差异的一对石杉植物中可能参与石杉碱生物合成与代谢调控基因的差异表达，为这方面研究提供了新的信息。

结果中最值得注意的是加双氧酶基因。加双氧酶在生物体中普遍存在，其催化底物添加一分子的氧，形成结构式中带有氧原子的产物，该酶是酮类物质合成所依赖的酶。本研究中该基因在高石杉碱含量的有柄马尾杉中表达量正常，而在低石杉碱含量的华南马尾杉中表达量几乎不表达，提示加双氧酶在石杉碱生物合成与代谢调控途径中扮演着重要的限速酶角色，估计与石杉碱甲结构中的吡啶酮环合成相关，可能直接导致了2种马尾杉植体中石杉碱甲的含量明显差异。

L-赖氨酸脱羧酶主要生物学功能是催化 L-赖氨酸脱羧生成1，5-戊二胺(尸胺)和二氧化碳。近年陆续证实多胺在生物体内广泛存在，可作为植物次生代谢产物生物碱的重要前体物质。本研究表明该基因在有柄马尾杉中表达量分别是华南马尾杉中的约180倍，说明该基因编码的蛋白质活跃于石杉碱代谢调控路径中，对石杉科植物体内石杉碱含量的积累具有明显的促进作用。

CYP450是植物中最大的蛋白家族之一, 以可溶性及膜结合(与内质网、线粒体等细胞器膜结合)两种形态存在，广泛参与包括氧化性脱氨、氧化性的碳碳键断裂等植物次生代谢反应[17-18]。其家族中CYP450-71A1、 CYP450-72A1、CYP450-74A1及CYP450-90A1等具备相似的催化性质，均具有充当电子载体活性以及单氧酶活性的能力，可加入或去除一原子的氧，对石杉碱特殊构象的形成具有重要作用。罗红梅等[7]筛选了蛇足石杉叶片中较根系高表达的CYP450基因，并认为其可能编码开链马钱子苷合成酶(secologanin synthase，SLS)，后者催化马钱子苷氧化断裂形成开链马钱子苷，证实了CYP450基因在石杉碱生物合成过程中的重要作用[19]。本研究中CYP450-71A1基因、CYP450-72A1基因在有柄马尾杉中表达量分别是华南马尾杉中的约33倍和223倍。可以这样判断，这2个基因编码的蛋白质活跃于石杉碱代谢调控路径中，它们的存在对石杉科植物体内石杉碱含量的积累具有促进作用。其中，CYP450-71A1基因编码的蛋白可能为加单氧酶，这可能是石杉定碱骨架转化为石杉碱甲结构中的吡啶酮环的作用酶，其表达直接影响石杉碱甲在石杉科植物体内的含量。而对于高表达的CYP450-72A1基因，因其注释结果与CYP450-74A1基因具有较高相似度，其编码细胞分裂素羟化酶。

N-甲基转移酶可以特异性识别底物并转移N原子位上的甲基[20]。在石杉碱甲合成中，该基因编码的蛋白定位于石杉碱生物合成途径下游石杉碱与石杉碱甲之间甲基转换的催化酶，使得石杉碱甲最终形成。在本研究关注的五个关键酶基因中，该基因是唯一一个有柄马尾杉较华南马尾杉略低表达的基因，说明该基因对于石杉碱生物合成虽不可或缺，但应该不是关键的限速酶。

石杉碱生物合成与代谢途径复杂，参与调控的酶种类也繁多，仍有许多不确定的中间体产物的存在，目前的研究只是开始，接下来可以筛选更多功能基因，开展基因的生物信息学分析并进行蛋白的结构与功能预测、理化性质与酶作用位点分析，以期为阐明石杉碱甲生物合成与代谢途径提供更多基础数据。

[1] Ma XQ,Tan CH,Zhu DY,Gang DR.Is there a better source of huperzine A than Huperzia serrata? Huperzine A content of Huperziaceae species in China[J].J Agric Food Chem,2005,53: 1393-1398.

[2] 陈业高，刘怡君，蒋金和，刘 波.石松类生物碱成分研究的新进展[J].云南师范大学学报， 2010，30 (6)：12-24.

[3] 易家宝，颜杰，李旭明.石杉碱甲结构改造的研究进展[J].天然产物研究与开发， 2009，21(6)：1080-1083，987.

[4] Hemscheidt T.Tropane and related alkaloids[J].Biosynthesis,2000,209:175-206.

[5] 陈作毅，张君诚.石杉碱生物合成与代谢途径研究进展[J].中华中医药杂志，2013，28(6)：1815-1818.

[6] Luo H,Li Y,Sun C,et al.Comparison of 454-ESTs from Huperzia serrata and Phlegmariurus carinatus reveals putative genes involved in lycopodium alkaloid biosynthesis and developmental regulation[J].BMC Plant Biol,2010,10:209.

[7] Luo H,Sun C,Li Y,et al.Analysis of expressed sequence tags from the Huperzia serrata leaf for gene discovery in the areas of secondary metabolite biosynthesis and development regulation[J].Physiol Plant,2010,139(1):1-12.

[8] 张君诚，黄晖，张杭颖，等.武夷山脉石杉科植物石杉碱甲含量的研究[J].植物遗传资源学报， 2011，12(4)：629-633.

[9] 殷秀梅，白志川，牛云云，等.蛇足石杉鲨烯合酶HsSQS1基因克隆和序列分析[J].药学学报， 2012，47 (8)：1079-1084.

[10] Livak KJ,Schmittgen TD.Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the2-ΔΔCTmethod[J].Methods, 2001,25(4):402-408.

[11] Ma XQ,Gang DR.In vitro production of huperzine A, a promising drug candidate for Alzheimer's disease[J].Phytochemistry, 2008,69(10):2022-2028.

[12] 苏经迁，黄彬，邱慧，等.产生物碱和石杉碱甲蛇足石杉内生真菌的初步研究[J].中国药学杂志， 2013，46(19)：1477-1481.

[13] Geerlings A,Hallard D,Martinez Caballero A,et al.Alkaloid production by a Cinchona officinalis' Ledgeriana'hairy root culture containing constitutive expression constructs of tryptophan decarboxylase and strictosidine synthase cDNAs from Catharanthus roseus[J].Plant Cell Reports,1999,19(2):191-196.

[14] 罗红梅， 张鑫， 牛云云，等.蛇足石杉 HsCAS1 基因克隆及序列分析[J].世界科学技术 (中医药现代化)， 2012，14(1)：1159-1165.

[15] 姬生国，潘胜利，霍克克.国产石杉科药用植物的分子生物学研究[D].复旦大学，2007.

[16] Jasinski M,Stukkens Y,Degand H,et al.A plant plasma membrane ATP binding cassette-type transporter is involved in antifungal terpenoid secretion[J].The Plant Cell Online,2001,13(5):1095-1107.

[17] Sono M,Roach MP,Coulter ED,et al.Heme-containing oxygenases[J].Chemical Reviews, 1996,96(7):2841-2888.

[18] Werck-Reichhartal D, Bak S, Paquette S.Cytochromes P450.in The Arabidopsis Book (eds.Somerville CR, Meyerowitz EM)[J].American Society of Plant Biologists,2002,1-29.

[19] Yamamoto H,Katano N,Ooi A,et al.Secologanin synthase which catalyzes the oxidative cleavage of loganin into secologanin is a cytochrome P450[J].Phytochemistry,2000,53(1):7-12.

[20] Choi KB,Morishige T,Shitan N,et al.Molecular cloning and characterization of coclaurine N-methyltransferase from cultured cells of Coptis japonica[J].J Biol Chem, 2002,277(1):830-835.

(编校：王冬梅)

Analysis of differential expression of the key enzyme genes involved in Huperzine A biosynthesis and metabolic pathways

ZHANG Jun-cheng1,2Δ,CHEN Zuo-yi1,Song Yu-hong1,2

(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Monitoring Resource Environment and Sustainable Management Utilization, Sanming 365004, China; 2.Research Center of Natural Medicines Engineer, Fudan University & Sanming College, Sanming 365004, China)

ObjectiveTo compare differential expression of the key enzyme genes involved in Huperzine A biosynthetic and metabolic pathways between Phlegariurus austrosinicus(ching)L.B.Zhang and Phlegariurus petiolatus (C.B.Clarke) H.S.Kung et L.B.Zhang.The key enzyme genes including such as L-lysine decarboxylase gene, Cytochrome P450 gene(CYP450-71A1 and CYP450-72A1), dioxygenase gene, and N-methyltransferase gene.MethodsExperimental materials were Phlegariurus austrosinicus and Phlegariurus petiolatus, they belonged to the family of Huperziaceae and live in the same habitat, but the contents of Huperzine A between them were of great difference.Their total RNAs were extracted and reverse transcribed into cDNA.Differential expression results were analyzed by fluorescence quantitative PCR, the PCR-primers were designed according to the published literature.ResultsThe dioxygenase gene expressed highly in Phlegariurus petiolatus and did not detected expression in Phlegariurus austrosinicus.Further, highly expressed genes in Phlegariurus petiolatus were L-lysine decarboxylase gene(about 180 times), Cytochrome P450-71A1(about 33 times) and Cytochrome P450-72A1(about 223 times).While, the amount of methyltransferase gene expression in the two materials was close. ConclusionDioxygenase gene is very likely to be the key rate-limiting enzyme that encoded protein of Huperzine A biosynthesis that lead the content of Huperzine A between the two materials to be of significant difference.The other genes that highly expressed genes in phlegariurus petiolatus were L-lysine decarboxylase gene, Cytochrome P450-71A1 and Cytochrome P450-72A1.These genes encoding the protein were active in the biosynthetic and metabolic pathways of the Huperzine A.Methyltransferase gene is catalyzing enzyme but not the key rate-limiting enzyme, it plays a part in the step of Huperzine transform into Huperzine A, that is in the end of Huperzine A biosynthetic and metabolic pathways.

Huperzine A; biosynthesis; gene; FQ-PCR

福建省自然科学基金面上项目(2012J01145)；福建省生物学重点学科开放基金项目

张君诚，博士，教授，研究方向：药用植物资源与生物技术研究，E-mail：5988603101@163.com。

R931

A

1005-1678(2015)01-0001-05