金钟晔，王少贤，白明华，李娜，景玉霞，3，刘群，陈家旭*

（1.北京中医药大学基础医学院，北京100029；2.河北医科大学中医学院，石家庄050051；3.新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐830054）

逍遥散对慢性束缚应激所致肝郁脾虚证大鼠饥饿素的影响

金钟晔1，王少贤2，白明华1，李娜1，景玉霞1，3，刘群1，陈家旭1*

（1.北京中医药大学基础医学院，北京100029；2.河北医科大学中医学院，石家庄050051；3.新疆医科大学中医学院，乌鲁木齐830054）

目的观察逍遥散对慢性束缚应激所致肝郁脾虚证大鼠饥饿素（Ghrelin）的影响，探讨逍遥散的作用机制。方法24只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、逍遥散组，每组8只；正常组不进行任何处理，模型组和逍遥散组通过连续21 d慢性束缚应激建立肝郁脾虚证候模型，逍遥散组于每天上午束缚前灌服逍遥散混悬液3.854 g／kg，正常组和模型组灌服生理盐水2 mL。比较各组大鼠的一般情况、饮水量及摄食量、体质量变化情况，用ELISA方法测定大鼠血浆及胃底部组织中Ghrelin的浓度。结果束缚21 d后，模型组大鼠体质量、摄食量、饮水量较正常组降低，增加减缓。与模型组相比，逍遥散组体质量、摄食量、饮水量均增加，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。模型组的血浆及胃底部Ghrelin含量比正常组低（P＜0.05），而逍遥散组的胃底部Ghrelin含量比模型组高（P＜0.05），与正常组相近；模型组的血浆Ghrelin含量低于逍遥散组（P＜0.01）。结论肝郁脾虚证模型大鼠血浆及胃底部组织中Ghrelin含量下降，逍遥散能提高Ghrelin水平，对肝郁脾虚证有明显调节作用，对Ghrelin的调节作用可能是逍遥散治疗肝郁脾虚证的可能机制之一。

慢性束缚应激；肝郁脾虚；逍遥散；饥饿素

饥饿素（Ghrelin）是KOJIMA等［1］于1999年首先应用免疫组化的方法发现在人和小鼠的下丘脑弓状核的核心处和胃内的分泌细胞有一种含28个氨基酸残基的多肽。Ghrelin能刺激释放生长激素，同时透过食欲的促进，使脂肪增加而升高体质量［2］。它广泛分布于多种组织器官，其中胃底泌酸腺的颈部和基部组织中浓度最高，占全身的20%左右，血液循环中70%的Ghrelin也是由胃底分泌的［3］。Ghrelin对调节摄食活动具有举足轻重的作用。研究表明，正常人体皮下注射Ghrelin往往引起饥饿反应，食物摄入量明显增加［4］。为了明确逍遥散对肝郁脾虚证调节机制，本实验采用21 d慢性束缚应激方法建立肝郁脾虚模型并进行评价；采用ELISA方法对胃底部及血浆中Ghrelin含量进行观察，分析肝郁脾虚证Ghrelin的变化及逍遥散的调节机制。

1 实验材料

1.1 动物与分组健康雄性SD大鼠24只，体质量180～200 g，清洁级，由北京维通利华实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK（京）2006-0009。实验动物提前购入，饲养于清洁级动物房，大鼠适应喂养1周后，按体质量随机分为正常组8只，不予束缚，灌服生理盐水；模型组8只，束缚21 d，灌服生理盐水；逍遥散组8只，束缚21 d，灌服逍遥散。动物每笼8只群养，室温（25±1）℃，相对湿度50%～60%，光照明暗各12 h（明7：00-19：00，暗19：00-次日7：00），喂常规饲料和饮用水。

1.2 中药及制备实验用药复方选用《太平惠民和剂局方》的逍遥散（北柴胡30 g，当归30 g，白芍30 g，白术30 g，茯苓15 g，炙甘草15 g，生姜10 g，薄荷10 g），由北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司提供，根据《北京市中药炮制规范》，按原书配伍比例由中日友好医院中药制剂室煎煮、浓缩成药粉备用。用时根据需要量用蒸馏水配制成一定浓度的溶液。

1.3 主要仪器大鼠束缚架和代谢笼由动物室提供。高速冷冻离心机，日立公司。超低温冰箱Forma-86℃，Thermo USA。自动电热压力蒸汽灭菌器ZDX-35BI，上海申安医疗器械厂。Ghrelin ELISA试剂盒，美国R＆D公司（由北京康源瑞得生物技术有限公司检测，检测仪器：Multiskan Mk3全自动酶标仪，Thermo Fisher Scientific公司）。

2 实验方法

2.1 模型制备及药物干预以慢性束缚方式制备大鼠模型［5］，将模型组和逍遥散组2组大鼠，束缚于特制的束缚架上（T型束缚台：底座宽10 cm、长20 cm、厚2.8 cm，上端束缚台长22 cm，最宽处6.6 cm，前端有固定头部的小架和适合四肢放置的凹槽，上端束缚台有两条可调的软带，分别在胸、腹部固定），每天3 h，束缚时间点随机，每次开始造模前30 min各组大鼠灌胃，逍遥散组灌服逍遥散混悬液［用药量3.854 g／（kg·d），按成人平均体质量70 kg／d用药量换算］。正常组和模型组灌服生理盐水2 mL。

2.2 体质量、摄食量、饮水量实验1、2、3周早上8：00，束缚前用电子称进行体质量、饮用水、饲料的称量。

2.3 取材及指标检测方法实验第22天，按0.4 g／100 g给药量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，断头取血2 mL于事先加入抗凝剂的试管中，4℃3 000 r／min离心10 min，分离血浆，抽取上清液，分别装至冻存管内，标记编号后-70℃保存，以备检测。解剖大鼠腹腔，取出胃，剪开胃大弯，用生理盐水涮洗2次至干净，滤纸吸干，剪取胃底部组织约100 mg，加入1 mL生理盐水制作10%匀浆，于4℃3 000 r／min离心30 min，取上清液于-70℃冰箱中保存备用。依照试剂盒说明书，用ELISA法检测大鼠胃底部和血浆中Ghrelin水平变化。

2.4 统计分析方法计量资料采用均数±标准差（¯x±s）表示，运用SPSS 17.0软件，对一般数据作正态分布和组间方差齐性检验。两项均符合，应用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行统计学处理，采用LSD法作组间比较，以P＜0.05作为差异存在统计学意义的界限。

3 实验结果

3.1 各组大鼠摄食量变化第1周，模型组和逍遥散组摄食量与正常组相比都有减少，差异有统计学意义（P＜0.01）。第2周，各组与第1周相比进食量基本没有变化。模型组与正常组相比有显著下降（P＜0.05），逍遥散组与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。第3周，正常组与第2周相比摄食量几乎无变化，模型组摄食量有减少，但逍遥散组的摄食量增加。3组之间比较发现模型组和正常组差异有统计学意义（P＜0.01），逍遥散组和模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05），逍遥散组与正常组摄食量接近，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠摄食量变化情况（¯x±s，n＝8）g

3.2 各组大鼠体质量变化第1周，模型组和正常组比较差异有统计学意义（P＜0.01），逍遥散组和正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。第2周，模型组和正常组相比差异有统计学意义（P＜0.01），逍遥散组和模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。第3周，模型组和正常组相比差异仍然有统计学意义（P＜0.01），逍遥散组和模型组相比差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠体质量变化情况（¯x±s，n＝8）g

3.3 各组大鼠饮水量变化造模第1周，模型组大鼠饮水量明显少于正常组（P＜0.01）。第2、3周，模型组大鼠饮水量较正常组有减少趋势，但差异无统计学意义，逍遥散组饮水量与正常组比较差异无统计学意义。见表3。

表3 各组大鼠饮水量变化情况（¯x±s，n＝8）g

3.4 慢性束缚应激后各组大鼠胃底部和血浆Ghrelin含量的变化模型组胃底部Ghrelin含量，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；逍遥散组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

模型组血浆Ghrelin含量，与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；逍遥散组与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表4。

表4 胃底部和血浆Ghrelin含量的变化分析（¯x±s，n＝8）

4 讨论

中医经典《灵枢》里的“司外揣内，司内揣外”是指通过观察事物外在表象，以揣测分析其内在状况和变化的一种思维方法。应激是动物受到各种因素强烈刺激时，所出现的一连串神经内分泌反应，以及由此所引起的机体的各种变化［5］。对于适当的应激，哺乳动物可以透过行为及内分泌方面的变化来维持内环境稳定状态，但慢性应激可能引起各种程度的心理或者身体障碍，引起脏腑失调、气血紊乱产生疾病，属于肝郁脾虚的范畴［6］。中医肝病的证候跟神经-内分泌-免疫系统的功能紊乱有密切关系［7］。逍遥散是治疗肝郁脾虚证的经方，许多实验已证明逍遥散对机体神经-内分泌-免疫系统的调节作用。以慢性束缚应激方法制作的肝郁脾虚证大鼠模型，可通过进食量、饮水量、体质量的变化判断模型的成功与稳定性［8］。正常组大鼠在整个实验过程当中与实验前基本一致，精神良好、活动度好、皮毛洁白润泽无脱落、眼角无异物、粪便麦粒形且干稀适中。逍遥散组大鼠动作灵敏、毛发润泽整洁，逍遥散组较模型组好，起到稳定的效应，表明逍遥散有很好的干预调节作用。

实验中，模型组随着造模的进行，逐步适应，束缚时大鼠表现为体质量增加缓慢，摄食量、饮水量有少于正常组的趋势。第2、3周，模型组明显出现摄食量减少。逍遥散组第1、2周与模型组类似，但由于药物作用，大鼠状况较模型组好。第3周，逍遥散组与正常组接近，与模型组比较有明显的差别。该结果与本课题组前期研究一致［9］。逍遥散组在整个实验过程中，体质量、摄食量、饮水量都高于模型组，逍遥散起到稳定的效应，表明逍遥散有很好的干预调节作用，证明慢性束缚应激方法建立肝郁脾虚大鼠模型成功。

Ghrelin主要由胃合成，通过原位杂交方法表明，Ghrelin的mRNA主要存在于胃底泌酸腺颈部和底部［1］。Ghrelin具有刺激垂体千叶释放生长激素（GH）、增加食欲、调节能量代谢平衡以及促进胃酸分泌等生物学功能［10］。Ghrelin对摄食和体质量调节的作用，长期应用会增加进食量，体质量增加［11］。大鼠在禁食、低血糖和注射瘦素（Leptin）时，胃内Ghrelin的表达上调，这说明Ghrelin在摄食活动中起到了重要的调节作用。有研究表明Ghrelin对大鼠的摄食量和胃酸分泌有促进作用［12］；正常人皮下注射Ghrelin会引起饥饿反应，食物摄入量明显增加［4］。

实验结果表明模型组的血浆Ghrelin浓度明显低于正常组和逍遥散组，与预测一致，经逍遥散治疗后可以升高血浆中的Ghrelin浓度，说明逍遥散能够调节Ghrelin的浓度。模型组胃底部的Ghrelin水平与正常组相比有显著性差异，逍遥散组与模型组之间也存在着明显的差异。由此可知，逍遥散能有效地行干预调节作用，调整组织中Ghrelin的浓度，进而有效地调整胃功能及增强食欲。综合分析实验大鼠的体质量、摄食量、饮水量结果，Ghrelin与体质量、摄食量、饮水量的关系为正比率关系，所以实验结果也与各家的众多研究一致［13-14］。实验结果表明逍遥散对消化和代谢功能也有很好的干预调节作用。这可能是逍遥散治疗肝郁脾虚证的作用机制之一。而具体的调节机制仍有许多可深入研究的部分。

逍遥散是疏肝解郁的名方，是针对肝郁脾虚血弱患者而设。慢性束缚应激是肝郁日久，木郁乘土，肝郁脾虚，气血紊乱而出现病理变化。逍遥散对肝郁脾虚证具有很好的调节作用。实验［15］证明逍遥散能够有效地提升肝郁脾虚证大鼠的脾胃功能，这种调节作用应该是经由多种通路和机制调控。本研究提示Ghrelin与慢性抑郁可能存在必然联系，并验证了逍遥散对Ghrelin的调节作用。本研究仅就有限的条件做一表浅的研究，但为进一步深入研究逍遥散对Ghrelin调节机制提供了实验依据。

［1］KOJIMA M，HOSODA H，DATE Y，et al.Ghrelin is a Growth-hormone-releasing Acylated Peptide from Stomach［J］.Nature，1999，402（6762）：656-660.

［2］叶丹，李红.Ghrelin研究进展［J］.国外医学（内科分册），2004，31（6）：264-266.

［3］HAYASHIDA T，MURAKAMI K，KAZUTAKA M，et al.Ghrelin in Domestic Animals：Distribution in Stomach and its Possible Role［J］.Domestic Animal Endocrinol，2001，21（1）：17-24.

［4］DRUCE M R，NEARY N M，SMALL C J，et al.Subcutaneous Administration of Ghrelin Stimulates Energy Intake in Healthy Lean Human Volunteers［J］.Int J Obes（London），2006，30（2）：293-296.

［5］李伟，陈家旭.慢性束缚应激大鼠海马BDNF TrkB NT3的变化及逍遥散对其影响［J］.中医药学刊，2005，23（7）：1205-1208.

［6］唐已婷，陈家旭.束缚应激与中医肝的关系［J］.中国医药学报，2002，17（2）：82-83.

［7］李晶晶，李晓红，王少贤，等.逍遥散对肝郁脾虚实验大鼠的治疗作用［J］.吉林中医药，2009，29（10）：901-903.

［8］岳利峰，丁杰，陈家旭，等.肝郁脾虚证大鼠模型的建立与评价［J］.北京中医药大学学报，2008，31（6）：396-400.

［9］李奎，冯杰，许梓荣.Ghrelin：一种新发现的生长激素释放肽［J］.生理科学进展，2005，36（3）：279-281.

［10］ZHANG J V，REN P G，AVSIAN-KRETCHMER O，et al.肥胖抑素与Ghrelin［J］.中国糖尿病杂志，2007，15（2）：123-124.

［11］胡亚美，江载芳.实用儿科学［M］.7版.北京：人民卫生出版社，2002：21.

［12］WERTZ-LUTZ A E，KNIGHT T J，PRITCHARD R H，et al.Circulating Ghrelin Concentrations Fluctuate Relative to Nutritional Status and Influence Feeding Behavior in Cattle［J］.Anim Sei，2006，84（12）：3285-3300.

［13］ASAKAWA A，INUI A，KAGA T，et al.Antagonism of Ghrelin Receptor Reduce Food Intake and Body Weight Gain in Mice［J］.Gut，2003，52（7）：947-952.

［14］TSCHOOP M，SMLEY D L，HEIMAN M L.Ghrelin Induces a Diposity in Rodents［J］.Nature，2000，407（6806）：908-913.

［15］于琦，金光亮.四逆散、逍遥散与四君子汤对慢性应激肝郁模型大鼠行为学影响的研究［J］.天津中医药，2007，24（6）：509-511.

Xiao Yao San on Ghrelin levels in rats with liver depression and spleen deficiency syndrome indeced by immobilization stress

JIN Zhongye1，WANG Shaoxian2，BAI Minghua1，LI Na1，JING Yuxia1，3，LIU Qun1，CHEN Jiaxu1*
（1.School of Preclinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2.College of Chinese Medicine，Hebei Medicine University，Hebei 050051，China；3.College of Chinese Medicine，Xinjiang Medicine University，Urumchi 830054，China）

ObjectiveThis experiment was designed to measure the effect of Xiao Yao San on treating liver depression and spleen deficiency syndrome by recording the changes of Ghrelin levels in the blood and the stomach bottom of fundic glands in chronic immobilization stress（CIS）model rats.MethodsThe 24 male SD rats were randomly divided into 3 groups（8 rats for each group）：normal group，model group and Xiao Yao San group.We didn’t make any deal with normal group，but model and Xiao Yao San groups by continuous 21 day immobilization stress cause induced liver depression and spleen deficiency syndrome，before every morning bondage administered Xiao Yao San（3.854 g／Kg·d）to the Xiao Yao San group and administered a saline liquid（2 mL）to the normal and model groups.We used ELISA to measure the Ghrelin levels inboth the blood and stomach bottom after death on day 22.ResultAfter 21 days，the model group rat body weight，food intake，water quantity increase slower than normal group.The Xiao Yao San group increase faster than model group，they have a statistical significance（P＜0.05 or P＜0.01）.The model group showed a significant decrease in the Ghrelin level contents in both the blood and stomach bottom compared to the Xiao Yao San and the normal groups（P＜0.05），but the Xiao Yao San group had a higher level of Ghrelin in stomach bottom than model group（P＜0.05）.Normal groups had similar Ghrelin level contents in stomach bottom；The model group had a lower level of Ghrelin in the blood than Xiao Yao San group（P＜0.01）.ConclusionXiao Yao San can effectively treat rats with immobilization stress induced liver depression and spleen deficiency condition by raising the levels of Ghrelin in both the blood and stomach bottom.

chronic immobilization stress；liver depression and spleen deficiency；Xiao Yao San；Ghrelin

R256

A

1003-5699（2015）09-0934-04

：张瑞彬

2014-11-17）

10.13463／j.cnki.jlzyy.2015.09.021

国家自然科学基金项目（30672578）；国家杰出青年科学基金课题（30825046）。

金钟晔（1974-），男，韩国籍，博士研究生，主要从事中医证候的病理生理基础研究。

*通信作者：陈家旭，电话-（010）64286656，电子信箱-chenjx＠bucm.edu.cn