夏敏媛，张瑜Δ，沈小林，秦军，缪轶君，谈献和

(1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；2.江苏苏中药业集团股份有限公司，江苏 姜堰 225500)



黄蜀葵茎枯病病原菌的分离与鉴定

夏敏媛1，张瑜1Δ，沈小林2，秦军2，缪轶君1，谈献和1

(1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；2.江苏苏中药业集团股份有限公司，江苏 姜堰 225500)

目的 分离黄蜀葵茎枯病病原菌并鉴定其种类。方法 取江苏省宜兴市采集的黄蜀葵发病植株病灶处(J)和健康处(W)的茎段，培养并筛选新生菌丝体，将分离获得的几种待定病原菌分别接种至健康黄蜀葵幼苗茎部，进行致病性检测，随后将获得的有效致病菌株进行病原菌形态学鉴定、PCR扩增和rDNA-ITS检测以确定菌种。结果 排除J与W中一致的菌种，分离得到3种真菌J2，J5和J6；致病性检测结果发现J5为有效致病菌；根据病原菌形态特征观察，初步鉴定J5为木贼镰刀菌；J5病原菌基因组DNA扩增后得到了长度为524 bp的条带，与木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)的ITS序列同源性最高，达到了100%。结论 黄蜀葵茎枯病病原菌为木贼镰刀菌F.equiseti。

黄蜀葵；茎枯病；致病菌；木贼镰刀菌

黄蜀葵Abelmoschusmanihot(L.) Medic.的干燥花冠称之为黄蜀葵花，性味甘寒，具有清热解毒、消炎利尿的功效[1]，始见于《嘉祐本草》。现代中药药理研究表明，黄蜀葵花具有明显的消炎、抗菌、止痛等作用[2]。近年来，黄蜀葵花及其提取物制剂的代表药物有黄葵胶囊、黄葵片等，其主要用于治疗感染性疾病如慢性肾炎，尿路感染等[3-4]，由于其疗效显著，深受患者肯定，临床需求量逐年增加。

目前，黄蜀葵花药材主要来自于人工栽培，存在着严重的连作障碍，主要表现为大面积重茬种植导致黄蜀葵病害频发且逐年加重。近年来，黄蜀葵茎枯病在全国各种植地时有发生，传播速度快，扩散面积大，严重影响了黄蜀葵花的产量和质量，部分地区甚至大面积绝收。前人并未报道过黄蜀葵茎枯病的研究，因而，本研究对黄蜀葵茎枯病病原菌进行了分离和鉴定，为今后开展黄蜀葵茎枯病防治工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物：黄蜀葵发病植株，健康黄蜀葵幼苗，均种植于江苏省宜兴市太华镇，经由南京中医药大学谈献和教授鉴定。

1.1.2 试剂：0.1%升汞溶液(姜堰市环球试剂厂)；PDA培养基(200 g切块的马铃薯放入1000 mL蒸馏水中加热，煮沸30 min后，过滤后加20 g琼脂，15 g琼脂制得)；1%琼脂糖凝胶(Bio Basic Inc.)；Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒及SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司；

1.1.3 引物：真菌rDNA-ITS区段通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)及ITS4(5’-TCCTCCGCTTA-TTGATATGC-3’)购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.1.4 仪器：BA300型生物显微镜(美国Motic公司)；2720 Thermal Cycler扩增仪(美国Applied Biosystems公司)；3730XL测序仪(美国Applied Biosystems公司)；FR980凝胶成像仪(上海复日科技仪器有限公司)；DHP-9162恒温培养箱(太仓市科技器械厂)。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离与培养：黄蜀葵发病植株2013年采自于江苏省宜兴市黄蜀葵栽培基地。用无菌刀片分别从病灶处(J)和健康处(W)切取1～1.5cm茎段，用0.1%升汞溶液消毒20 s后，再用75%乙醇消毒1 min，再次用无菌水冲洗，在PDA培养基上恒温(25 ℃)培养3 d。从培养的茎段组织挑取少量新生菌丝体，将初步筛选的病原菌接至PDA培养基，纯化后装入斜面培养基4 ℃保存备用。

1.2.2 致病性测定：经过初步筛选，将分离获得的几种备用病原菌分别接种至PDA培养基上，恒温(25 ℃)暗培养3 d后，接种至田间生长的健康黄蜀葵幼苗茎部，接种位置距离地面 10～15 cm。接种时先用无菌接种针顺着垂直地面方向划出伤口，挑去少量备用病原菌菌丝接种至伤口部位，喷洒适量无菌水进行润湿，平行3组实验。田间种植的黄蜀葵接种病原菌，自然发病。接种5d后观察发病情况。

1.2.3 病原菌形态学观察：将致病性测定结果中的有效致病菌株在PDA培养基上恒温(25 ℃)培养7 d，观察菌落颜色、形态，测量菌落直径大小变化；14 d后用显微镜观察真菌分生孢子的大小，形态，隔膜数目以及产孢结构。

1.2.4 病原菌rDNA-ITS序列分析

① 基因组DNA提取：经过致病性测定，将黄蜀葵致病菌于25 ℃在PDA培养基上培养5 d后，取0.1 g菌丝体，于液氮中研磨成粉末，用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取DNA，DNA提取液直接用于PCR扩增。

② rDNA-ITS区段扩增：用真菌rDNA-ITS区段通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)扩增病原菌基因组DNA。PCR反应体系为25 μL，包括：Template(基因组DNA20～50ng/ μL)0.5 μL，10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL，dNTP(各2.5 mM)1 μL，Taq DNA聚合酶(2.5U/ μL)0.2 μL，F(10 μM)0.5 μL，R(10 μM)0.5 μL，加双蒸水至25 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃修复延伸10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，同时Bio-Rad 凝胶成像系统进行观察、照相。

③ 纯化及测序：在紫外等照射下切取的目的条带，经SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒纯化后，由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

④ 同源性比较：测得序列经BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)与NCBI数据库中的已知序列进行同源性比较。鉴定黄蜀葵茎枯病病原菌归属。

2 结果

2.1 病害症状描述 黄蜀葵茎枯病发病部位在其茎部。通常最先危害其茎上部，随后向两侧扩散蔓延。发病部位茎秆干枯呈深褐至黑色，该部位及其以上部分逐渐坏死(见图1)。发病初期：黄蜀葵茎部出现多个紫色斑点，植株直立正常；发病中期：病斑发黑扩散，发病部位皱缩，植株萎蔫、叶片呈干枯状卷曲垂下；发病后期：植株死亡。

图1 致病菌侵染植株3 d后发病情况Fig.1 Symptom of diseased Abelmoschus manihot (L.) after inoculation with pathogen for three days

2.2 病原菌分离情况 从发病的黄蜀葵病灶处(J)与健康处(W)分离得到的真菌中，排除J中与W一致的菌种，初步确定3种真菌J2，J5和J6为黄蜀葵茎枯病病原菌。

2.3 致病性测定 为了验证候选病原菌的致病性，对田间种植的黄蜀葵进行接种实验。实验发现，J5病原菌接种3 d后，接种部位长出紫色病斑，并迅速向周围蔓延，病株叶片呈失水状下垂、皱缩，症状与田间茎枯病发病植株相同；J2、J6病原菌接种3 d后，出现紫斑，7 d后仍健康生长；对照组植株健康生长。从病灶处重新提取病原微生物，结合显微观察发现，此次分离获得的菌种与原接种菌在各项形态特征上完全一致。

2.4 显微鉴定 黄蜀葵病灶处分离得到的有效真菌J5，在PDA培养基上生长率为5.8 cm，从平板底部观察其颜色变化，先为桃红，后变为浅黄褐色，最后变成深棕色。具有絮状气生菌丝，产孢。从培养基上挑取少量菌丝，镜检发现大量分生孢子和分生孢子梗。大分生孢子镰刀形，具有一个逐渐变窄的顶细胞和小梗样的足细胞，略微向内弯曲，4～7个薄而清晰的分隔(5～7个占多数)；厚垣孢子成链或成结。根据病原菌形态特征观察，参考Booth[5]的《镰刀菌属》一书，初步鉴定黄蜀葵病原菌为木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)。

2.5 病原菌分子鉴定 J5病原菌基因组DNA经通用引物ITS1-ITS4扩增，得到长度为524 bp的扩增条带(见图2、图3)。通过与已知序列同源性比较发现，扩增条带的核苷酸序列与GenBank中Fusariumequiseti的ITS序列(登录号：KJ412501、JQ690085、AB425996、KM246255和KM111481)同源性最高，达到了100%。综合致病性测定、形态学特征观察以及ITS结果分析，最终确认本研究分离的黄蜀葵茎枯病病原菌为木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)。

图2 引物ITS1和ITS4扩增的凝胶电泳条带Fig.2 Agarose gel electrophoresis of ITS region amplified by primers ITS1 and ITS4

图3 ITS1和ITS4扩增的核苷序列表达Fig.3 Presentation of ITS sequences that amplified by ITS1 and ITS4

3 讨论

本文描述的黄蜀葵茎部病害症状与易茜茜等[6]对荆芥茎枯病的发病症状的描述基本一致。本课题组在进一步研究及查阅文献后[7-8]认为，黄蜀葵的该发病现象应称之为“茎枯病”。

迄今，并未有关于黄蜀葵茎枯病的文献报道。仅仅通过形态观察将镰刀菌菌株鉴别到种，对于非微生物学、非分类学专业的初学者来说存在很大的难度[9]。近年来，利用特异性PCR、特征DNA序列等分子技术辅助鉴定镰刀菌的方法已经被广泛应用[10]。本研究根据病原菌形态学特征初步鉴定到种，按照同源性比较结果，及致病性测定结果最终确定了黄蜀葵茎枯病病原菌为木贼镰刀菌Fusariumequiseti。

本研究所采集的病样中分离后进行反接种，同时有3种菌种使健康植株发生变化。其中分离的J5木贼镰刀菌Fusariumequiseti接种到健康的黄蜀葵植株7 d后发黑萎蔫枯死，这与黄蜀葵茎枯病田间自然发病现象相同；同时分离得到的J2曲霉菌Aspergillus以及J6烟管菌Bjerkandera(同样通过rDNA-ITS测序方式确定的种类)虽然能引起健康植株的叶片出现紫红色斑纹，但发病现象缓慢，未能致死健康植株，这与黄蜀葵田间发病规律不符。综上，可推断出曲霉菌以及烟管菌并非黄蜀葵茎枯病的病原菌，而是其发病部位滋长的腐生真菌。但具体侵染过程及相对病害的影响有待进一步研究。

本研究初步确定了江苏省宜兴市黄蜀葵茎枯病的致病菌，对于研究茎枯病相关病害的流行规律及治理方法具有重要意义，同时为镰刀菌引起的相关病害的防止奠定了一定的基础。进一步的研究将致力于木贼镰刀菌Fusariumequiseti的生理活性、致病力及杀菌剂敏感性等方面，为相关病害的综合治理提供依据。

[1] 国家药典委员会.中国药典[S].一部.2010：287.

[2] 刘爽，江蔚新，吴斌.黄蜀葵化学成分及药理活性研究进展[J].中国现代中药，2010，12(8)：5-9.

[3] 陈岱.黄葵胶囊治疗慢性肾炎疗效观察[J].中国中西医结合肾病杂志，2001，2(5)：299-230.

[4] 徐锡兰，邬嘉琛，黄启金.黄蜀葵花胶囊治疗慢性肾炎湿热证43例[J].山东中医药大学学报，2000，24(5)：345-347.

[5] Booth C(Translated by Chen QY).Fusarium genus(in Chinese)[M].Beijing:Agriculture Press,1988.

[6] 易茜茜，张争，丁万龙，等.荆芥茎枯病病原菌的分离与鉴定[J].植物病理学报，2010，40(5)：530-533.

[7] 佘小漫，何自福，罗方芳.广东广藿香青枯病病原菌鉴定[J].植物病理学报，2012，42(6)：569-576.

[8] 杨迎青，李湘民，孟凡，等.芦笋茎枯病抗性鉴定方法的建立及芦笋抗病种质资源的筛选[J].植物病理学报，2012，42(6)：649-654.

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[10] Hsuan HM,Salleh B,Zakaria L.Molecular identification of Fusarium species in Gibberella fujikuroi species complex from rice,sugarcane and maize from Peninsular Malaysia [J].Int J Mol Sci,2011,12(10):6722-6732.

(编校：王俨俨)

Isolation and identification of pathogen causing stem blight disease onAbelmoschusmanihot(L.) Medic

XIA Min-yuan1, ZHANG Yu1Δ, SHEN Xiao-lin2, QIN Jun2, MIAO Yi-jun1, TAN Xian-he1

(1.School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China; 2.SZYY Group Pharmaceutical Limited, Jiangyan 225500, China)

ObjectiveTo isolation and identify the pathogen of stem blight of Malvaceae.MethodsThe stems were collected from stem blight-diseased plants (J) and healthy ones (W) ofAbelmoschusmanihot(L.) Medic.in Yixing City of Jiangsu Province then cultured to isolate newborn mycelium.The pathogen isolated but unidentified were inoculated in stems of healthy plants ofAbelmoschusmanihot(L.) Medic.and pathogenicity was verified.Finally, the pathogenic specie(s) was or were identified by morphological characteristic, rDNA-ITS analysis and polymerase chain reaction (PCR) method.ResultsThe same fungus were excluded which were the same species in J and W, the three fungus of J2, J5 and J6 were acquired.J5 was preliminarily identified to have pathogenicity and it wasFusariumequisetiunder the microscope.The genome DNA of J5 was amplified to a length of 524bp, and homology highly withFusariumequiseti(100%).ConclusionThe pathogen was identified asFusariumequiseti.

Abelmoschusmanihot(L.) Medic.; stem blight; pathogen;Fusariumequiseti

江苏高校优势学科南京中医药大学中药学学科开放研究课题(2011ZYX6-014)

夏敏媛，女，硕士在读，研究方向：中药资源生产研究，E-mail：xia2299@qq.com；张瑜，通讯作者，女，研究员，硕士生导师，副教授，研究方向：中药资源生产研究，E-mail：catyuer@163.com。

S435.67

A

1005-1678(2015)09-0012-03