张浩军，冯玉康，张怡，王文鹏，修亚丽，姜国志，张明正，王正品

(1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.中药注射剂新药开发技术国家地方联合工程实验室，河北 石家庄 051430；3.辛集市第一医院 病理科，河北 辛集 052360；4.希百寿药业有限公司，河南 开封 475003)



HPGFC法检测抗乙肝胎盘转移因子高分子量物质的研究

张浩军1Δ，冯玉康1，张怡3，王文鹏1，修亚丽1，姜国志2，张明正4，王正品2

(1.神威药业集团有限公司，河北 石家庄 051430；2.中药注射剂新药开发技术国家地方联合工程实验室，河北 石家庄 051430；3.辛集市第一医院 病理科，河北 辛集 052360；4.希百寿药业有限公司，河南 开封 475003)

目的 测定抗乙型肝炎胎盘转移因子(anti-HBV placenta transfer factor，PSTF)的高分子物质组成和分子量。方法 利用柱色谱法将PSTF中高分子量的组份分离，再采用高效凝胶过滤色谱法(high performance gel filtration chromatography，HPGFC)测定PSTF组份中高分子量物质的分子量。结果 通过对分离到的PSTF中高分子量成份的检测，其分子量为9485.9Da。结论 PSTF应是多肽和核苷酸的复合物。

抗乙型肝炎胎盘转移因子；高效凝胶过滤色谱；高分子量物质

抗乙肝胎盘转移因子采用健康产妇分娩的HBsAg阳性胎盘，经提取超滤精制而成，用于慢性乙肝的治疗。自20世纪80年代在我国试制成功，经实验研究和临床观察均证明具有免疫活性，临床使用获得较好的效果，尤其对病毒性肝炎疗效较显著[1-5]。抗乙型肝炎胎盘转移因子(anti-HBV placenta transfer factor,PSTF)属免疫调节剂，是低分子量制剂(规定分子量小于1万)。为确保临床用药的安全和有效，需对样品做分子量限度检查。据文献报道，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laster desorption ionization-time of flight mass spectrometer,MALDI-TOF-MS)检测其主成份分子量为2942 Da，高分子量物质为8197 Da[6]。质谱法检测虽精确，但操作难度大且检测费用昂贵。HPGFC法在检测精度和便捷性之间取得较好的平衡。

本文采用高效凝胶过滤色谱(HPGFC)对3批抗乙型肝炎胎盘转移因子注射液(以下简称：样品)进行分子量测定实验。取核糖核酸酶A、人胰岛素和生长抑素的保留时间(Rt)和分子量的对数值(lg Mr)进行线性回归，得回归方程lg Mr=a+b×Rt。在回归方程中b为负值，分子量越大则保留时间小，将样品色谱图中各峰的保留时间代入回归方程，计算得到该保留时间下的分子量。根据最早峰的保留时间即可判定样品中的高分子物质的分子量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器： Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent 1100高效液相色谱仪(Agilent科技(中国)有限公司)；756PC紫外可见光分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。

1.1.2 药品与试剂 ： 供试品：抗乙型肝炎胎盘转移因子注射液(希百寿药业，批号：20121101，20121102，20121103)。

对照品：核糖核酸酶A(分子量：13700 Da，批号：140653-201203)、人胰岛素(分子量：5808 Da，批号：140654-201203)和生长抑素(分子量：1638 Da，批号：140656-201203)均购自中国食品药品检定研究院。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件[7]：色谱柱： YMC Pack Diol-200 (300 mm×8.0 mm，5 μm)；流动相：0.1 mol/L磷酸盐缓冲液，pH 7.0(内含0.05% NaN3，0.1 mol/L Na2SO4)；进样量：20 μL；流速：0.6 mL/min；柱温：25 ℃；检测波长：260 nm。

1.2.2 对照溶液的制备：将核糖核酸酶A、人胰岛素和生长抑素分别用流动相溶解，配制成浓度为2 mg/mL。进样量20 μL。

1.2.3 样品处理：精密量取本供试品0.5 mL置10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。

1.2.4 检测方法：取稀释20倍的样品20 μL 注入色谱仪，记录谱图。

1.2.5 系统适用性试验：将等体积的核糖核酸酶A、人胰岛素和生长抑素溶液分别与样品混合，分次注入液相色谱仪进行测定，记录色谱图。计算连续进样6次保留时间的RSD 。

1.2.6 重复性试验：取对照品适量依1.2.2项下处理，连续进样6次，记录色谱图，计算RSD。

1.2.7 中间精密度试验：取对照品适量按1.2.2项处理，在同一实验室，采用不同实验人、不同实验时间和不同仪器操作，按上述方法测定，连续进样3次；2台色谱仪同法进样，记录色谱图，计算RSD。

1.2.8 稳定性试验：取对照品适量依1.2.2处理，在0、4、8、12、18、24 h，分别进样，记录色谱图，计算RSD。

1.2.9 样品各组份的分离、纯化：分离用SephadexG 75凝胶柱，柱规格为100 cm×1.5 cm，洗脱液为0.2 mol/L NaCl，流速为40 mL/h，上柱样品经减压浓缩至50 mg/mL，上样量为4 mL，用自动记录仪检测，收集液在200～400 nm进行扫描。各组份保存待验。对最早出峰组份进行纯度鉴定。

1.3 样品组份的测定：分别将核糖核酸酶A、人胰岛素和生长抑素及样品第一组份注入色谱，记录色谱图。

2 结果

2.1 样品和对照品色谱图 样品出现4个主要峰，与对照品色谱峰无重叠，用分子筛柱能够较好的分离。见图1。

图1 样品和对照品的HPLC色谱图

2.2 系统适用性试验 连续进样6次保留时间的相对标准偏差小于2%，见表1。表明核糖核酸酶A、人胰岛素、生长抑素与样品在色谱系统的系统适用性良好。色谱图结果表明对照品与样品无干扰，见图2。

表1 核糖核酸酶A、人胰岛素和生长抑素分别在样品中的保留时间

图2 各对照品与样品的HPLC色谱图Fig.2 HPLC Chromatography of each reference substance and sample with PSTF

2.3 重复性试验 该方法下RSD小于2.0%，表明对照品重复性良好。见表2。

表2 对照品的保留时间重复性试验结果

2.4 中间精密度试验 该方法下RSD小于2.0%，表明对照品中间精密度良好。见表3。

表3 对照品各成分保留时间的中间精密度试验结果

2.5 稳定性试验 该方法下RSD小于2.0%，表明对照品在24 h内稳定性良好。见表4。

表4 对照品稳定性试验结果

2.6 样品各组份分离、纯化 峰1是高分子量物质，对其按1.2.1法进行纯度鉴定为92%以上。见图3、图4。

图3 SephadexG-75的色谱图Fig.3 Chromatography of SephadexG-75

图4 峰1的色谱图Fig.4 Chromatography of peak 1

2.7 样品的紫外吸收光谱 在 254nm处有最大紫外吸收。见图5。

图5 峰1的紫外吸收光谱Fig.5 UV absorption chromatography of peak 1

2.8 分子量计算[8]对照品的回归方程lg Mr=5.2881-0.0635×Rt，R=0.999。样品中分离纯化后峰1中多肽的保留时间见表5。表5结果表明该方法下RSD小于2.0%，表明样品重复性良好。分子量9485.9 Da。用标准曲线求得，未分离纯化的样品峰1中多肽的分子量为9440.5 Da。

表5 样品中峰1的保留时间

3 讨论

抗乙肝胎盘转移因子经HPGFC分析，有4个组份，以峰2和峰3含量最高，占峰面积的91.5%；峰1占峰面积的5.3% 。经分离纯化后峰1为样品中分子量最大的组份，多肽分子量为9485.9 Da；且与样品色谱图中峰1保留时间计算得的多肽分子量变化不大。检测样品峰1组份分子量时可不必分离后再检测。

经检测峰1纯品水溶液在254 nm处有最大吸收，254 nm为核苷酸碱基的吸收。推测峰1是多肽和核苷酸的复合物。化学法测定样品中核苷酸的含量为80 μg/mL，多肽含量为0.6 mg/mL，多肽:核酸=7.5:1。曾有文献报道，抗乙型肝炎胎盘转移因子确为多肽和核酸的混合物，水解后测得17种氨基酸[9]，与之相符。

MALDI-TOF-MS已广泛用于多肽、糖、核酸等生物大分子的分子量测定[10-12]。不同的待测材料所选用的基质也不相同[13]，经此法检测样品中高分子量多肽的分子量为8197 Da；较本文测得峰1的分子量9485.9 Da偏小，通过对3批样品的检测，结果一致。 这很可能与多肽结合低分子量核苷酸有关。将来在质量控制时应对多肽和核酸的分子量分别予以关注。

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(编校：王冬梅)

Study on high molecular component of anti-HBV placenta transfer factor by HPGFC

ZHANG Hao-jun1Δ, FENG Yu-kang1, ZHANG Yi3, WANG Wen-peng1, XIU Ya-li1, JIANG Guo-zhi2, ZHANG Ming-zheng4, WANG Zheng-pin2

(1.Shineway Pharmaceutical Group Co., Ltd.，Shijiazhuang 051430, China; 2.State-Local Joint Engineering Lab.of New Drugs Development Technology for TCM Injection, Shijiazhuang 051430, China; 3.Department of Pathology, The First Hospital of Xinji, Xinji 052360, China; 4.Sepaso Pharmaceutical Co., Ltd., Kaifeng 475003, China)

ObjectiveTo determine high molecular component and high molecular weight of anti-HBV placenta transfer factor(PSTF).MethodsUsed the gel column chromatography to separate component of PSTF.Detected molecule weight of the high molecule component of PSTF by HPGFC.ResultsThe molecular weight of the separated high molecular weight component of PSTF is 9485.9Da.ConclusionPSTF is a complex of peptides and nucleotides.

PSTF; HPGFC; high molecular compoent

国家重大专项(2011ZX09401-306-004)

张浩军，通信作者，男，硕士，工程师，研究方向：药品工艺技术、质量研究及产业化研究，E-mail：13931197421@139.com。

R979.5

A

1005-1678(2015)10-0134-04