姚文亮，陈胜辉

(南昌市医学科学研究所附属医院 男科，江西 南昌 330001)



补肾强精颗粒改善特发性弱精子症患者DNA完整性的临床研究

姚文亮Δ，陈胜辉

(南昌市医学科学研究所附属医院 男科，江西 南昌 330001)

目的 探讨补肾强精颗粒改善特发性弱精子症患者DNA完整性的临床效果。方法 选取南昌市医学科学研究所附属医院男性不育门诊特发性弱精子症患者110例，采用随机数字表法将患者分为3组，治疗组(n=40)采用补肾强精颗粒治疗，对照组(n=40)采用五子衍宗丸治疗，空白对照组(n=30)给予安慰治疗，比较3组间精液参数与精子DNA碎片化指数(DNA fragmentation index，DFI)的差异。结果 治疗组治疗有效率明显高于对照组与空白对照组，对照组治疗有效率明显高于空白对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。治疗前后，3组间患者精液量、液化时间、a、a+b、a+b+c级精子百分率、精浆果糖与酸性磷酸酶水平比较差异无统计学意义。治疗前，3组间患者精子密度、精子畸形率、α-糖苷酶与DFI比较差异无统计学意义，治疗后，治疗组精子密度明显高于对照组与空白对照组，精子畸形率、DFI明显低于对照组与空白对照组，对照组DFI明显低于空白对照组，组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Pearson相关性分析显示，精子密度与DFI呈明显的负相关(r=-0.354)，精子畸形率与DFI呈正相关(r=0.324)。结论 DNA完整性异常的主要原因为肾功能失调，补肾强精颗粒可作为改善精子DNA完整性的有效药物。

补肾强精颗粒；特发性弱精子症；DNA碎片化指数

特发性弱精子症是常见的男性不育疾病之一，世界卫生组织(WHO)研究表明，不育夫妇中，男性存在生殖缺陷占50%以上[1]。精子DNA损伤与男性生育能力紧密相关，精子DNA损伤严重影响受精比率、胚胎发育与子代健康等。精子DNA碎片化指数(DNA fragmentation index，DFI)成为了男性生育能力的主要影响因素[2]。南昌市医学科学研究所附属医院采用中药(补肾强精颗粒)治疗有助于改善特发性弱精子症患者辅助生殖技术结局、男性生育能力与精子DNA完整性中具有重要的意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月～2015年1月期间南昌市医学科学院附属医院男性不育门诊特发性弱精子症患者110例，采用随机数字表法将患者分为治疗组(n=40)，对照组(n=40)与空白对照组(n=30)。3组在年龄、病程与DFI等一般资料间比较差异无统计学意义。

诊断标准：参照WHO制定的特发性弱精子症诊断标准[3]：①育龄男性与女性同居1年以上，有正常性生活，不采用任何避孕措施，女性生殖功能正常，男性精液异常导致不能生育者；② 2周内2次以上精液常规参数显示精子活力低于正常标准值，而无明显病因。

纳入标准：23～45岁，已婚男性，符合特发性弱精子症诊断标准，DFI%≥10%，同意参加本试验研究并签署知情同意书。本研究经本院伦理委员会批准。

排除标准：输精管阻塞或缺如、成人双侧隐睾、两性畸形、免疫因素、VCⅡ°以上、睾丸萎缩、先天性精路梗阻等原因导致不育患者;有生殖道感染，性传播疾病，降压降糖，抗癫痫与抗肿瘤等影响生精药物服用史；癌症放化疗患者，合并造血系统、肝肾、心血管、精神病等疾病患者；药物过敏，不遵医嘱服药，临床资料不完整、试验期间退出等影响疗效与安全性评估患者。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法：治疗组患者采用补肾强精颗粒(南昌市男科医院生产，批号：2011Z0037)10 g、温水冲服，2次/天；对照组患者采用五子衍宗丸(通药制药股份有限公司生产,国药准字Z20043603)6 g，2次/天，空白对照组给予安慰治疗，不采用药物治疗。

1.2.2 检测方法：①精液参数：禁欲3～7 d，手淫取精，室温下静置30 min后采用FT-9200DNA荧光染色精子动(静)态图像分析系统(北京航天瑞琪科技发展有限公司)测定精液量、pH值、液化时间、精子密度、精子运动级别[活率(a+b+c)级精子百分率、活力(a+b)级精子百分率]、精浆果糖、α-糖苷酸、酸性磷酸酶，采用瑞-吉氏染色法计算精子畸形率。②DFI：服药前后3个月内分别检查DFI，检测步骤如下：精液标本室温下液化，采用PBS缓冲液洗涤3次，离心，精液沉淀物混悬至50×106/mL。15 μL重悬液涂片。空气干燥，采用Carnoy’s液(乙酸/甲醇，1:3)固定精液涂片3 h或整夜。冲洗、空气干燥后采用新鲜AO染色液(Sigma公司)染色5 min，AO染色液需每天配置：1%AO原液10 ml+0.1 mmol/L枸橼酸40 mL+0.3 mmol/L，pH 2.5 Na2HPO4·7H2O 2.5 mL。避光条件下，1%AO原液、0.1 mmol/L枸橼酸可储存4周，轻柔冲洗，干燥，荧光显微镜(AxioskopZplus,Carl zeiss, Thronwooa, NY, USA)下观察。

1.2.3 观察指标

① 临床疗效[4]：DFI降至正常范围且女方怀孕者评定为治愈；DFI降至正常范围且女方未怀孕者评定为显效；DFI较治疗前明显降低，下降幅度≥10%者评定为有效；DFI较治疗前无明显改变或升高者评定为无效，治疗总有效率=治愈率+显效率+有效率。

② 精液常规参数：服药前后3个月内，比较3组特发性弱精子症患者精液常规参数[精液量、液化时间、精子密度、a级精子百分率、(a+b)级精子百分率、(a+b+c)级精子百分率、畸形率]与精浆成分(精浆果糖、α-糖苷酶、酸性磷酸酶)的差异。

③ 精子DNA完整性：DNA正常精子百分比：400倍荧光显微镜450～490 nm下观察精子200个以上，正常双链DNA精子荧光呈绿色，DNA受损精子荧光呈红色、橙色、黄色。DFI=(受损DNA精子数)/精子总数)×100%。精子DNA完整性异常诊断标准：DFI%≥10%，轻度异常10%～19%，中度异常 20%～29%，重度异常≥30%[5]。

2 结果

2.1 3组间一般资料比较 3组在年龄、病程与DFI等一般资料间比较差异无统计学意义。

表1 3组间一般资料情况比较

2.2 3组间临床疗效比较 治疗组治疗有效率明显高于对照组与空白对照组，对照组治疗有效率明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 3组间临床疗效比较

*P<0.05，与空白对照组比较，compared with blank control group；#P<0.05，与对照组比较，compared with control group

2.3 3组间精液常规参数比较 治疗前后，3组间患者精液量、液化时间与精子百分率比较差异无统计学意义，治疗前，3组间患者精子密度、精子畸形率比较差异无统计学意义。治疗后，治疗组精子密度明显高于对照组与空白对照组(P<0.05)，精子畸形率明显低于对照组与空白对照组(P<0.05)，且治疗组精子密度明显高于同组治疗前，精子畸形率明显低于同组治疗前，治疗前后比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 3组间精液常规参数比较

*P<0.05，与空白对照组比较，compared with blank control group；#P<0.05，与对照组比较，compared with control group；△P<0.05，与治疗前比较，compared with pre-treatmant

2.4 组间精浆成分与DFI比较 治疗前后，3组间精浆果糖、酸性磷酸酶水平比较差异无统计学意义。治疗前，组间α-糖苷敏、DFI比较差异无统计学意义。治疗后，治疗组α-糖苷敏明显高于对照组与空白对照组(P<0.05)；DFI明显低于对照组与空白对照组，对照组DFI明显低于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。治疗组α-糖苷敏明显高于同组治疗前，DFI明显低于同组治疗前，治疗前后比较差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 3组间精浆成分与DFI比较

*P<0.05，与空白对照组比较，compared with blank control group；#P<0.05，与对照组比较，compared with control group；△P<0.05，与治疗前比较，compared with pre-treatmant

2.5 精液参数与DFI的关系 Pearson相关性分析结果表明：精子密度、畸形率与DFI相关，其中精子密度与DFI呈负相关(r=-0.354)，精子畸形率与DFI呈正相关(r=0.324)。见表5。

表5 精液参数与DFI的关系

续表

3 讨论

环境污染与医源性措施等因素均能导致精子DNA损伤，严重影响精子DNA完整性。精子发生独特而复杂，精子形成过程中，组蛋白逐渐被鱼精蛋白替代。鱼精蛋白通过中和DNA电荷，降低DNA分子间的静电作用，与二硫键交联形成致密胞核；在精子转运过程中，鱼精蛋白与精子DNA的保护和抵抗卵细胞胞质内形成成熟促进因子(mature promoting factor, MPF)，从而确保遗传物质完整性。但特发性弱精子症患者精子DNA完整性异常，其精子DNA变性程度明显高于正常生育人群，其中精子质量与精子DNA损伤呈负相关，精液常规参数异常者精子DNA变性程度明显高于精液常规参数正常者[6]。同时，特发性弱精子症患者生精细胞系XY非整倍体与XY二倍体、精子DNA断裂、精子染色质异常水平升高，提示特发性弱精子症患者存在多精子水平缺陷，而非单纯性精子数量减少导致的[7]。精子DNA完整性影响妊娠率与受精率，精子DNA断裂水平与精子质量与呈负相关，其中精子DNA断裂水平>20%，妊娠率与受精率的显著下降[8]。因此，DNA完整性对男性生育功能具有重要的预测价值。相关研究表明，口服药物、体外培养与精子制备技术均能有效改善精子DNA完整性[9]。其中口服药物简便易行，有助于临床推广应用，药物干预通过显著改善患者DFI，恢复精子DNA完整性，提高精子质量与数量，是治疗精子DNA损伤的有效手段，但目前尚未发现最为显著有效的口服药物。中医学认为特发性弱精子症与肾功能具有明显的相关性，参照“阴成形、阳化气”，“内肾外肾”、“精血同源”等理论，通过采用补肾强精疗法有效调理肾功能，有助于改善精子发育与成熟的环境[10]。因此，中医药在改善特发性弱精子症的临床治疗中发挥重要的作用，并积累了丰富的经验。本院通过长期治疗特发性弱精子症所累积的临床经验，制备了补肾强精颗粒。大量临床实践证实，补肾强精颗粒在治疗特发性弱精子症的临床疗效显著，但目前尚缺乏对精子DNA完整性的影响研究[11]。

本研究通过观察补肾强精颗粒对特发性弱精子症患者精液参数[精液量、液化时间、精子密度、a级精子百分率、(a+b)级精子百分率、(a+b+c)级精子百分率、畸形率]、精浆成分(精浆果糖、a-糖苷酶、酸性磷酸酶)与精子DNA完整性的影响，结果显示：补肾强精颗粒患者治疗有效率最高，其次为五子衍宗丸，揭示了补肾强精颗粒治疗特发性弱精子症患者的临床疗效显著；其中中药治疗后，全部患者精液量、液化时间、a、a+b、a+b+c级精子百分率、精浆果糖与酸性磷酸酶等精液参数指标均有明显改善，而补肾强精颗粒治疗患者精子密度明显升高，精子畸形率、DFI明显降低，其中补肾强精颗粒DFI降低幅度最为显著，其次为五子衍宗丸。Pearson相关性分析显示，精子密度与DFI呈明显的负相关，精子畸形率与DFI呈明显的正相关，提示补肾强精颗粒在改善DFI中的作用最为显著。补肾强精颗粒主要成分为甘草、皂角刺、沙苑子、肉苁蓉、杜仲、山茱萸、枸杞子、肉桂、熟地、黄芪等，具有温肾益精、填髓壮阳之功效，皂角刺具有排脓消肿、活血化瘀之功效，沙苑子具有补肾益精之功效，肉苁蓉具有壮阳之功效，杜仲具有补肾虚之功效，山茱萸具有涩精补肾之功效，枸杞子具有补肾精、滋养肾阴之功效，肉桂具有壮阳、抗肿瘤、抗菌等功效，甘草调和诸药，诸药配伍共发挥益肾壮阳之功效。同时，枸杞子具有抗氧化作用，避免高浓度活性氧对精子DNA的损伤；熟地能促进内皮细胞增殖功能，促进正常细胞凋亡，有助于清除DNA受损的精子[12]。因此，补肾强精颗粒对特发性弱精子症患者精子DNA完整性具有重要的改善作用，可改善辅助生殖治疗的结局，有效解决不孕不育问题。

综上所述，DNA完整性异常的主要原因为肾功能失调，补肾强精颗粒可作为改善精子DNA完整性的有效药物。

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(编校：吴茜)

Clinical study on effect of kidney essence granule on improvement of DNA integrity in patients with idiopathic weak sperm

YAO Wen-liangΔ, CHEN Sheng-hui

(Pepartmenf of Andrology,Nanchang Institute of Medical Sciences, Nanchang 330001, China)

ObjectiveTo investigate clinical effect of kidney essence granule on DNA intergrity in patients with idiopathic weak sperm.Methods110 cases of idiopathic weak sperm disease in outpatient service of male infertility were selected, and divided into 3 groups using random number table method, treatment group (n=40) treated with strong kidney essence granule and control group (n=40) by Wuzi Yanzong pill treatment, blank control group (n=30) given placebo treatment.Semen parameters and sperm DNA fragmentation index (DFI) differences were compared within groups.ResultsThe efficacy of treatment group was significantly higher than control group and blank control group, and control group was significantly higher than blank control group, the differences were all statistically significant (P<0.05).There was no significant difference among the 3 groups of patients within semen volume, liquefaction time, a,(a+b),(a+b+c) grade sperm percentage, seminal plasma fructose and acid phosphatase level pre-and post-treatment. Pre-treatment, sperm density, sperm abnormality rate, α-glycosides and DFI were not significantly different among the 3 groups.Post-treatment, sperm density in treatment group was significantly higher than that in control group, and sperm deformity rate and DFI were significantly lower than that in control group, and that in control group was significantly lower than that in blank control group (P<0.05).Pearson correlation analysis showed that the sperm density was negatively correlated with DFI(r=-0.354), and the sperm deformity rate was positively correlated with DFI(r=0.324).ConclusionThe main reason for abnormal DNA integrity are renal dysfunction, and kidney essence granule can be used as an effective medicine to improve the integrity of sperm DNA.

kidney essence granule; idiopathic weak sperm disease; DNA fragmentation index

江西省卫计委中医药科研基金，南昌市科技支撑项目(2014A153)

姚文亮，通信作者，男，硕士，副主任中医师，研究方向：男性不育症的诊断与治疗，E-mail：jiangxiywl@163.com。

R277.5

A

1005-1678(2015)10-0025-04