杜振广，肖明明，景士兵，徐绍年*

(1.辽宁省人民医院骨肿瘤科，辽宁 沈阳 110016；2.辽宁省人民医院病理科，辽宁 沈阳 110016)

实验研究

EGFR在骨肉瘤中的表达、基因扩增及其临床意义

杜振广1，肖明明2，景士兵2，徐绍年1*

(1.辽宁省人民医院骨肿瘤科，辽宁 沈阳 110016；2.辽宁省人民医院病理科，辽宁 沈阳 110016)

目的 探讨表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)在骨肉瘤中的蛋白表达及基因扩增，并评估其在骨肉瘤发生、发展和预后中的价值。方法 以石蜡包埋组织芯片为材料，分别采用免疫组织化学PV-9000两步法与荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)技术检测32 例骨肉瘤及10 例骨软骨瘤中EGFR蛋白表达及基因扩增。结果 EGFR蛋白在骨肉瘤、骨软骨瘤中的表达阳性率分别为84.4%、20.0%；扩增阳性率分别为75%、20%；骨肉瘤中EGFR蛋白表达、基因扩增阳性率与骨软骨瘤相比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；在骨肉瘤中EGFR蛋白表达、基因扩增阳性率与患者的年龄、性别、肿瘤部位无相关性(P>0.05)，与肿瘤转移、临床分期相关(P<0.05)。结论 EGFR与骨肉瘤的发生、发展有关，可以将其作为判断骨肉瘤生物学行为的重要参考指标。

骨肉瘤；表皮生长因子受体；免疫组织化学；荧光

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是骨恶性肿瘤中最常见的一种，目前仍是儿童和青少年恶性肿瘤死亡率很高的疾病[1]。寻找判断肿瘤的预后或对临床治疗具有指导意义的分子标记并进行选择性靶向治疗，对提高骨肉瘤治疗的效果有重要意义。有学者报道骨肉瘤的发生、发展过程主要是由于癌基因的激活和抑癌基因的丢失[2]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族是一种癌基因，与肿瘤的发生发展密切相关，参与细胞的增殖、调亡，进而参与细胞恶变。本实验采用组织芯片免疫组织化学PV-9000两步法与荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)技术检测32 例骨肉瘤中EGFR表达情况，探讨EGFR与骨肉瘤临床病理特征的关系，为选择治疗方式及判断患者预后提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 一般材料 收集辽宁省人民医院2003年1月至2014年6月手术切除并经病理确诊为骨肉瘤的存档石蜡包埋组织蜡块32 例(股骨20 例、胫骨8 例、其他4 例)，骨软骨瘤10 例，术前均未做过化疗及放疗。32 例病例中男18 例，女14 例；中位年龄18 岁；骨肉瘤Ennecking外科分期：Ⅰ期3 例，Ⅱa期8 例，Ⅱb期9 例，Ⅲ期12 例；其中失访8 例，转移者15 例，无转移者9 例。将蜡块切5 μm切片1张，经HE染色后，在蜡块上选取骨肉瘤组织区，采用手工组织芯片制备仪，制备成每个瘤组织标本直径为2 mm组织芯片，从制作好的芯片蜡块上切5 μm切片3张，分别用于HE染色、FISH及免疫组织化学分析。

1.2 主要试剂和方法

1.2.1 组织芯片蜡块制备 预制受体蜡块，将受体蜡块软化，打孔，固定蜡块，针点间间隔1 mm，按10×6阵列每个受体蜡块打孔60个。打孔完成后，放上取样平台，将供体蜡块放在取样平台上，使用点样针在预先做好取样标记的供体蜡块上取样，将点样针取出的样本填入受体蜡块的蜡孔中，将组织芯片蜡块放在65℃烤箱中30 min，使其完全熔合，将自然冷却的组织芯片蜡块放在冷冻台上5 min，制备完毕。

1.2.2 免疫组织化学PV-9000二步法 鼠抗人EGFR单克隆抗体(武汉博士德生物科技有限公司)，PV-9000二步法试剂盒(北京中杉金桥生物科技有限公司)。组织芯片蜡块切片脱蜡水化，浸5 min；3%双氧水室温孵育10 min，磷酸缓冲液冲洗，滴加稀释的EGFR抗体(1︰100)，4℃过夜，磷酸缓冲液冲洗，滴加试剂1，37℃孵育20 min，磷酸缓冲液冲洗，滴加试剂2，37℃孵育20 min，磷酸缓冲液冲洗，显色剂显色；自来水充分冲洗，复染，脱水透明，封片。用磷酸缓冲液代替EGFR抗体作为阴性对照，阳性对照为已知的EGFR阳性骨肉瘤组织切片。

1.2.3 FISH方法 LSI EGFR/CEP 7探针(北京金菩嘉公司)、蛋白酶K(北京金菩嘉公司)。将组织切片烘烤3 min，脱蜡，脱水，复水。浸入去离子水中3 min。100℃沸水煮玻片20 min，蛋白酶K终浓度100 μg/m消化；将组织切片置于2XSSC溶液中漂洗5 min，1%甲醛室温固定10 min。玻片依次置于-20℃预冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中各2 min脱水，将组织切片室温浸入丙酮溶液中2 min，自然干燥玻片，加热玻片至56℃。将10 μL探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封片，准备杂交仪器。共变性条件：83℃ 5 min；42℃ 16 h，玻片洗涤：0.3% NP40 65℃ 1.5 min；0.1% NP40室温30 s，70%乙醇3 min，暗处自然干燥玻片；室温，将15 μL DAPI复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片。暗处放置10～20 min，在荧光显微镜下选用合适的滤片组观察玻片。在Olympus BX51型荧光显微镜下选用合适的滤片组观察玻片，以大于75%的细胞核内大于等于2个EGFR信号判断杂交成功。

1.2.4 结果判读方法 免疫组织化学结果判读：结果采用双盲法，由两位有经验的医师独立读片。根据显色强度分为阴性、弱阳性、中度阳性和强阳性，分别记分数为0，1，2，3分。阳性细胞在病变细胞中所占比例大致分为：阳性细胞小于25%，记1分；阳性细胞25%～50%，记2分；阳性细胞数50%～70%，记3分；阳性细胞数大于70%，记4分。根据半定量乘积法，0～3分为(-)，4～6分为(+)，7～8分为(++)，9分以上为(+++)。

FISH结果判读探针LSI EGFR/CEP 7为红/绿双色，其中EGFR基因为红色信号，7号染色体着丝粒序列为绿色信号，由两位病理医师随机计数细胞观察，结果一致方可认定。随机计数100个细胞，统计Ratio值(Ratio值=100个细胞核中红信号总数/100个细胞核中绿信号总数)，如果Ratio大于等于2及出现成团集簇扩增细胞视为EGFR基因扩增阳性。

1.2.5 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析，阳性表达率的比较用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 在骨软骨瘤与骨肉瘤中EGFR蛋白表达与基因扩增情况 32 例骨肉瘤中，EGFR蛋白表达阳性27 例(84.4%)，EGFR基因扩增24 例(75.0%)。在10 例骨软骨瘤中EGFR蛋白表达2 例(20%)，EGFR基因扩增2 例(20%)(见图1～4)。

图1 骨肉瘤表达(HE，×400) 图2 骨肉瘤中EGFR阳性表达(PV9000，×400) 图3 FISH检测骨软骨瘤EGFR基因无扩增(×1000) 图4 FISH检测骨肉瘤中EGFR基因扩增，如白色圆圈内所示(×1000)

表1 骨软骨瘤与骨肉瘤中EGFR蛋白表达与基因扩增

2.2 EGFR蛋白表达与基因扩增与骨肉瘤临床病理因素之间的关系 Ennecking分期Ⅰ期和ⅡA期EGFR阳性表达率63.6%，ⅡB期和Ⅲ期阳性表达率为95.2%，差异有显著性(P=0.002)；有转移组中阳性表达率为93.3%，未转移组中阳性表达率为55.6%，差异有显著性(P=0.047)；EGFR蛋白的表达与性别、年龄、肿瘤部位无关(P>0.05)。EGFR基因扩增在骨肉瘤中为75.0%，明显高于在骨软骨瘤中的20.0%，差异有显著性(P=0.006)；Ennecking分期中Ⅰ期和ⅡA期基因扩增为45.5%，ⅡB期和Ⅲ期基因扩增为95.0%，差异有显著性(P=0.010)；有转移组中基因扩增为86.7%，未转移组中基因扩增为33.3%，差异有显著性(P=0.021)；EGFR基因扩增情况与性别、年龄、肿瘤部位无关(P>0.05，见表2)。

表2 EGFR蛋白表达、基因扩增与骨肉瘤临床病理因素之间的关系

3 讨 论

EGFR是原癌基因的表达产物，具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体[3]。EGFR在多种肿瘤中如结肠癌[4]、肺癌[5]、食道癌[6]、乳腺癌[7]、子宫颈癌[8]、卵巢癌[9]、胰腺癌[10]、神经胶质瘤[11]高水平表达。EGFR的表达强度与恶性肿瘤的细胞的增殖、血管的形成、黏附性、是否有转移、对放射敏感性等方面都关系密切，已经成为分子靶向治疗的关键点[12]。近年来，分子靶向药物越来越多的受到重视，当前已研发了相关EGFR靶向药，部分已经应用于临床，并取得了较好疗效，如EGFR靶向药吉非替尼、西妥昔等。目前已经有10种以上EGFR靶向抑制剂，在针对不同肿瘤的治疗中，取得了显著的疗效[13]。

虽然对骨肉瘤的发病机制还不是很明确，但随着生命科学尤其是分子生物学技术的发展，基因靶向治疗为骨肉瘤的治疗开辟了一条新途径。理所当然，新基因靶点的寻找就成为了近年来研究的热门，目前文献报道EGFR与骨肉瘤关系都仅限于蛋白表达水平。本实验研究发现，与骨软骨瘤相比，EGFR蛋白在骨肉瘤中高表达，阳性表达率为84.4%，基因扩增为75.0%，表明骨肉瘤具有高表达EGFR的特性，提示骨肉瘤中EGFR高表达在骨肉瘤的发生、发展过程中可能发挥着重要作用。在与各临床病理因素之间的分析研究中发现，随着骨肉瘤恶性程度(Enncking外科分期)的递增，EGFR蛋白阳性表达及基因扩增与之相应升高，提示EGFR蛋白表达及基因扩增可以作为骨肉瘤恶性程度及预后的判断指标。本课题组在研究中，通过组织芯片筛选，发现在骨肉瘤中EGFR高表达，因而在本项课题研究中，进一步明确骨肉瘤中EGFR表达的生物学意义。明确是否可以通过靶向抑制EGFR，而逆转骨肉瘤细胞的增殖、黏附、迁移、侵袭等肿瘤的恶性生物学行为，将为临床治疗是否可以利用EGFR靶向抑制剂治疗骨肉瘤、完善骨肉瘤的治疗方案、寻找新的骨肉瘤治疗途径提供理论依据。

综上所述，EGFR在骨肉瘤发生、发展过程中起着重要作用。随着对EGFR的信号通路与骨肉瘤关系研究的不断深入，必将能够为骨肉瘤生物靶向治疗提供一种新的生物靶点，为骨肉瘤患者的治愈带来新的希望。

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The Expression of EGFR Protein，Gene Amplification and Its Clinical Significance in Osteosarcoma

Du Zhenguang1，Xiao Mingming2，Jing Shibing2，Xu Shaonian1

(1.Department of Bone Tumor，People′s Hospital of Liaoning Province，Shengyang 100016，China；2.Department of Pathology，People′s Hospital of Liaoning Province，Shengyang 100016，China)

Objective To investigate the expression of EGFR protein and gene amplification in osteosarcoma and evaluation of EGFR in osteosarcoma occurrence，development and prognosis.Methods PV-9000 two step method and in situ chemical hybridization (FISH) were used to detect the expression of EGFR protein，gene amplification in 32 cases of osteosarcoma and 10 cases of osteochondroma in paraffin-embedded tissue chip material.Results The positive rate of EGFR expresion in osteosarcoma，osteochondroma were 84.4%、20.0%.The positive rate of EGFR gene amplification were 75% and 20%.There were significant differences between osteosarcoma and osteochondroma in the expression and amplification of EGFR.The ex-pression and amplification of EGFR in osteosarcoma had no correlation with age，gender，or the location of the tumor(P>0.05)，but were correlated with metastasis and clinical stage(P<0.05).Conclusion EGFR is closely related to the occurrence and development of osteosarcoma，and can be considered as an important index for determing the biological behavior of osteosarcoma.

osteosarcoma；EGFR；immunohistochemistry；fluorescence

1008-5572(2015)04-0328-04

R738.1

A

2014-09-30

杜振广(1978- )，男，副主任医师，辽宁省人民医院骨肿瘤科，110016。

*本文通讯作者：徐绍年