刘 凯， 杨亚军， 田俊策， 鲁艳辉， 徐红星， 郑许松， 吕仲贤*

1浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021；2浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004

种植Bt水稻后的土壤对赤子爱胜蚓生长发育及酶活性的影响

刘 凯1,2， 杨亚军1， 田俊策1， 鲁艳辉1， 徐红星1， 郑许松1， 吕仲贤1,2*

1浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江 杭州 310021；2浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江 金华 321004

【背景】转基因作物种植的安全问题一直备受关注。关于Bt蛋白对地下非靶标生物影响的研究是转基因作物安全评价的重要内容。【方法】在转Bt基因水稻收割后的稻田里分别种植豌豆、紫云英和油菜作为后茬作物。分别于2013年1、3和6月3次采集不同后茬作物田中的土壤作为材料，于室内饲养赤子爱胜蚓，4周和7周后，测定蚯蚓的生长发育指标、存活率以及体内酶活性的变化情况。此外，还测定了不同深度土壤中Bt蛋白的含量以及用Bt蛋白直接饲喂的赤子爱胜蚓的存活率。【结果】与种植过非转基因水稻MH63的土壤相比，分别种植过含cry2A和cry1C基因水稻后的土壤对赤子爱胜蚓的生长发育、存活率及体内酶活性无显著影响。1月份和3月份转cry2A基因水稻田以及1月份转cry1C基因水稻田采集的表层土样中的Bt蛋白含量显著高于地下10 cm和地下20 cm土壤中的含量，地下2层土样中的Cry2A蛋白含量之间无差异。3月份转cry1C基因水稻田以及6月份转cry2A和转cry1C基因水稻田的土壤中Bt蛋白的含量均不受土壤深度的影响。种植的后茬作物对土壤中的Bt蛋白无显著消解作用。室内模拟土壤最高Bt蛋白浓度的条件下，Cry2A蛋白处理的蚯蚓存活率为96.7%，Cry1C蛋白处理的蚯蚓存活率为95.0%，两者与对照相比无显著差异。【结论与意义】转cry2A和cry1C基因Bt水稻的种植对蚯蚓的生长发育和体内酶活性无显著影响。本研究为转基因水稻的安全评价提供了一定的依据。

转Bt基因水稻； 后茬作物； 土壤Bt蛋白含量； 赤子爱胜蚓； 生长率； 死亡率； 酶活性

全球转基因作物的种植面积已达1.75亿hm2(James,2013)，为降低农田系统中化学农药投入、增加农民收益以及保护自然环境做出了贡献(Gómezetal.,2008)。转基因作物的种植对非靶标生物的影响一直是人们关注的焦点(Lundgrenetal.,2009; Villiers & Hiisington,2011)。目前商业化种植的转基因作物中主要的杀虫蛋白基因来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)。转Bt基因作物种植过程中产生的Bt蛋白能通过根系分泌(郭永灿等,1997； 王建武和冯远娇,2005a； Saxena & Stotzky,2000; Saxenaetal.,1999)、花粉飘落(Saxenaetal.,2002)、残茬分解或秸秆还田(王建武等,2005b； 邢珍娟等,2008)以及土壤动物活动(袁一杨和戈峰, 2010)等方式进入到土壤系统，Bt蛋白能快速地吸附于土壤活性颗粒(土壤粘土矿物、腐质酸以及有机矿物聚合体等)的表面，与之紧密结合以避免被生物降解，并能保持至少8个月甚至4年的杀虫活性(Crecchio & Stotzky,2001; Icoz & Stotzlcy,2008; Tapp & Stotzky,1995; Vaufleuryetal.,2007; Zwahlenetal.,2003)。

土壤中聚集的Bt蛋白是否会被后茬作物所吸收，从而随同食物进入人体，也是人们关心的问题。而后茬作物的种植是否会加速土壤中Bt蛋白的降解还仍未知。

蚯蚓是土壤中常见的杂食性环节动物，在土壤生态系统中占有重要地位，对土壤物理性状改良和植物营养循环具有重要作用(Cortez & Bouche,2001)。由于蚯蚓直接暴露于土壤的污染物中，对多种污染物较敏感，因此常被作为指示生物，成为土壤污染生态毒理诊断的重要指标，被广泛应用于土壤生态毒性的研究(刘廷凤等,2009)。蚯蚓的存活率和生长发育是Bt作物对蚯蚓影响研究中的主要生态指标(张艳艳等,2012)。目前，关于Bt作物对蚯蚓体内酶的影响开展了很多研究，主要包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、谷胱甘肽S-转移酶、乙酰胆碱酯酶和纤维素酶等(舒迎花等,2011; 肖能文等,2005; Liuetal.,2009)。

本研究在室内条件下，用种植过Bt水稻的土壤饲养赤子爱胜蚓，观察赤子爱胜蚓的生长发育和存活情况，同时测定其体内总蛋白的含量、乙酰胆碱酯酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性，旨在探究转Bt基因水稻的种植是否会对蚯蚓的生长发育及体内酶的活性产生影响；并测定了种植不同后茬作物后，土壤中的Bt蛋白含量，试图探究后茬作物的种植是否会影响土壤中残留Bt蛋白的含量；另外，在大于土壤中测得的Bt蛋白含量的浓度条件下(Cry2A蛋白的浓度1.5 μg·mL-1，Cry1C蛋白浓度80 ng·mL-1)，于室内饲养赤子爱胜蚓，观察此浓度对蚯蚓存活率的影响，旨在验证土壤中的Bt蛋白是否会影响蚯蚓的存活。这些研究结果可为转Bt基因水稻的安全评价提供有力的理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

水稻：转Bt基因水稻品种T2A-1和T1C-19，分别表达cry2A和cry1C基因；非转基因对照品种明恢63(MH63)，亲本(籼稻)。3种水稻种子均由华中农业大学提供。

转基因试验田：浙江金华石门农场(N：29°01′16.7″, E：119°37′17.7″，海拔106 m)，试验田东西长71.30 m，南北宽26.5 m，面积0.19 hm2。试验田平分为4大区，每个大区再分为9个小区，共36个小区，小区之间间隔0.5 m，大区之间间隔1 m(图1)。每个小区长11 m，宽3.5 m，面积38.5 m2。行距25 cm，株距15 cm，每个小区种15行73排共1095丛水稻。水稻5月底育秧，6月底移栽，各个小区均正常水肥管理，10月中旬收割后烧毁。11月初分别种植3种后茬作物:豌豆PisumsativumL.、油菜BrassicacampestrisL.和紫云英AstragalussinicusL.。

土壤：供试土壤取自转基因试验田。分别于2013年1月、3月和6月采集土样。每块稻田分3点采集，按照20 cm×20 cm的规格采集土壤样品，装入自封袋中带回实验室用于饲养蚯蚓。以相同标准分别采集土壤表层、地下10 cm及20 cm深处的土壤，分别装入自封袋，带回实验室于5 ℃保存，待测其中Bt蛋白的含量。

图1 转基因田示意图Fig.1 Experimental design of this transgenic field study 1： MH63； 2： T1C-19； 3： T2A-1； A： 豌豆 Pisum sativum； B： 油菜 Brassica campestris； C： 紫云英 Astragalus sinicus； D： 空白 Blank。

蚯蚓：试验所用的赤子爱胜蚓由浙江省农业科学院农药所提供。试验时选择2月龄以上、体重300～600 mg、环带明显、大小一致的健康成蚯蚓，试验前，室温下清肠2 h。

Cry1C和Cry2A Bt蛋白：购于武汉科诺生物科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 土壤中Bt蛋白含量的测定 采用Envirologix公司ELISA Cry1C和Cry2A蛋白定量检测试剂盒检测,每个处理重复5次。根据标准曲线计算Bt蛋白的含量，用每克干土中所含的 Bt蛋白含量(ng·g-1)表示。

1.2.2 Bt蛋白对赤子爱胜蚓存活率的影响 根据土壤中测定的Bt蛋白(Cry1C蛋白和Cry2A蛋白)含量，设定Cry1C蛋白浓度80 ng·mL-1和Cry2A蛋白浓度1.5 μg·mL-1。试验采用滤纸法(王彦华等,2010)，在直径9 cm的培养皿底部垫入直径为11 cm的单层滤纸(滤纸包住培养皿边缘)。将2 mL配置好的Bt蛋白溶液滴加到滤纸上，同时设置空白对照组。每个培养皿中加入6条已清肠的蚯蚓，用保鲜膜封口，并用解剖针在保鲜膜扎孔以保持透气性，试验于人工气候室[(20±1) ℃、相对湿度80%～85%]中进行。每个处理10个重复。72 h后统计蚯蚓的存活数，以蚯蚓前尾部对机械刺激无反应视为死亡，并计算存活率。

1.2.3 Bt水稻种植后的土壤对蚯蚓存活率和死亡率的影响 将田间取回的土壤绞碎均匀后称取400 g装入柱状塑料盒(直径15 cm，高11 cm)中，每盒放入6条体重200～300 mg的蚯蚓。用解剖针扎孔的保鲜膜封口后，饲养于人工气候室中(条件同1.2.2)。每个处理设置9个重复。在第4周和第7周时，取出蚯蚓放在室温下清肠2 h，用无菌水洗净，经滤纸干燥后，称量其总体重，计算生长率。同时统计死亡率。试验结束后，将蚯蚓保存在-70 ℃冰箱中，以供酶源制备。

1.2.4 蚯蚓体内总蛋白含量和解毒酶活性的检测 每个处理选取3条健壮、大小一致的蚯蚓，剪成数段放入预冷的匀浆器中，按体质量1∶10加入预冷的0.9%生理盐水，匀浆后4 ℃、10000 r·min-1离心10 min，取上清液于-70 ℃下冷藏，待测酶活性。

1.2.5 蚯蚓体内酶活性测定 总蛋白含量的测定：参照考马斯亮蓝法，以牛血清蛋白做标准曲线，测定上清液中总蛋白含量。

乙酰胆碱酯酶活性和总蛋白的测定：采用南京建成科技有限公司的试剂盒进行测定。

谷胱甘肽S-转移酶活性测定：在96孔酶标板中每孔依次加入90 μL 0.1 mol·L-1、pH 7.6的磷酸缓冲液、10 μL酶液、100 μL 1.2 mmol·L-1的CDNB和100 μL的6 mmol·L-1的GSH。用酶标仪每隔20 s记录一次D340 nm，共记录150次。酶促反应阶段温度27 ℃。以反应速度表示酶活力(ΔD340 nm·min-1·mg-1)。

1.3 数据统计与分析

生长率=(Wt-Wo)/Wo,Wo为蚯蚓初始重量，Wt为处理t天后蚯蚓重量。

死亡率=(Do-Dt)/Do,Do为初始蚯蚓数，Dt为存活蚯蚓数。

采用SPSS 18.0软件对试验数据反正弦平方根转换后进行双因素方差分析并采用Tukey进行多重比较。采用Student-Newman-Keuls检验(P<0.05)比较不同处理条件下蚯蚓总蛋白含量和酶活性的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同深度土壤中Bt蛋白含量

由表1可知，随着取样时间的延长，土壤中Cry1C蛋白的含量显著降低(P<0.01)。在相同取样时间和取样深度的条件下，种植3种后茬作物的土样中Cry1C蛋白的含量与空白对照(抛荒田)相比无显著差异。1月份采集的土样中，表层土样中的Cry1C蛋白含量显著高于地下10 cm和地下20 cm，而地下2层中Cry1C蛋白的含量差异不显著。3月份和6月份采集的土样中Cry1C蛋白的含量基本不受土壤取样深度的影响，不同深度间Cry1C蛋白的含量无显著差异。Cry2A蛋白含量随着取样时间的延长而显著降低(P<0.01)，相同时间相同深度的条件下，种植3种后茬作物的土壤中Cry2A蛋白含量与对照(抛荒田)相比无显著差异(P=0.548)。在1月和3月的土样中，表层土壤中Cry2A蛋白含量显著高于地下10 cm和地下20 cm土壤中Bt蛋白含量，地下10 cm和地下20 cm土壤中Bt蛋白含量差异不显著。6月份采集的土壤中，各土层中Cry2A蛋白的含量均无显著差异。

表1 Bt水稻田经不同后茬作物种植的土壤中Bt蛋白的含量(ng·g-1)Table 1 Amounts of Bt insecticidal proteins in the different soil samples in after-reap Bt rice (ng·g-1)

表中数据为平均值±标准误。同列数据后附不同大、小写字母者表示同一时期不同处理在0.01、0.05水平上差异显著。

The data in the table represent means±SE. Different small and capital letters in the same column mean significant difference among treatments at the same time at 0.05 and 0.01 levels.

2.2 特定Bt蛋白浓度对赤子爱胜蚓存活率的影响

根据土壤中Bt蛋白的含量设定Cry2A蛋白的浓度为1.5 μg·mL-1，Cry1C蛋白浓度为80 ng·mL-1,饲养72 h后，Cry2A处理的蚯蚓存活率为96.7%，Cry1C处理的蚯蚓存活率为95.0%，空白对照蚯蚓的存活率为98.3%。结果表明，经过2种Bt蛋白处理，蚯蚓的存活率与对照相比无显著差异。

2.3 不同处理条件下蚯蚓的生长率与死亡率

方差分析结果显示，取样时间、后茬作物、水稻品种、取样时间和后茬作物的交互作用、取样时间和水稻品种的交互作用、后茬作物和水稻品种的交互作用以及取样时间、后茬作物和水稻品种的交互作用对蚯蚓4周和7周生长率与死亡率均无显著影响(表2～4)。

2.4 经Bt水稻种植后的土壤对蚯蚓体内解毒酶的影响

田间取样试验结果表明，经Bt水稻种植后的土壤饲养的蚯蚓，4周和7周后体内的总蛋白含量以及解毒酶AChE和GSTs活性与对照相比无显著差异(表5)。

表2 Bt水稻田经不同后茬作物种植的土壤饲养的赤子爱胜蚓的生长率(%)Table 2 Growth rates(%) of E.foetida cultivated under laboratory conditions exposed to the three Bt rice cultivars at weeks 4 and 7

表中数据为平均值±标准误。同列数据后附不同小写字母者表示同一时期不同处理在0.05水平上差异显著。

The data in the table represent means±SE. Different small letters in the same column mean significant difference among treatments at the same time at 0.05 level.

表3 Bt水稻田经不同后茬作物种植的土壤饲养的赤子爱胜蚓的死亡率(%)Table 3 Mortality rate (%) of E.foetida cultivated under laboratory conditions exposed to the three Bt rice cultivars at weeks 4 and 7

表中数据为平均值±标准误。同列数据后附不同小写字母者表示同一时期不同处理在0.05水平上差异显著。

The data in the table represent means±SE. Different small letters in the same column mean significant difference among treatments at the same time at 0.05 level.

表4 不同处理对蚯蚓生长发育影响的双因素方差分析Table 4 Three-way ANOVA comparing growth and mortality rates of E.foetida under different conditions

表5 经Bt水稻种植后的土壤对赤子爱胜蚓体内总蛋白含量以及解毒酶活性的影响Table 5 Activities of detoxification enzymes and contents of protein of E.foetida cultivated under laboratory conditions exposed to the three Bt rice at weeks 4 and 7

表中数据为平均值±标准误。同列数据后附不同小写字母者表示同一时期不同处理在0.05水平上差异显著。

The data in the table represent means±SE. Different small letters in the same column mean significant difference among treatments at the same time at 0.05 level.

3 讨论

蚯蚓是土壤生物中生物量较大的类群之一，主要以作物残留物为食，在植物残体的降解和土壤中营养物质的循环过程中起重要作用。蚯蚓的挖穴和取食活动能改善土壤和土壤中有机质的结构，影响着土壤的疏松性和通气性，并能为土壤中其他生物改善生物资源(Schampheleireetal.,2007)。

Saxenaetal.(2002)在前茬种植Bt玉米田中种植非Bt玉米、胡萝卜和小萝卜等，20～120 d后，在后茬作物中没有检测出Bt蛋白，而土壤中的Bt蛋白晶体依然存在。在无菌营养液中种植转Bt基因玉米15 d后，再将非Bt玉米种子移栽到该营养液中，7～15 d后，在非Bt玉米中没有检测到Bt蛋白。本研究检测了田间不同深度的土样中Bt蛋白的含量，结果显示无论是转cry2A基因水稻田还是转cry1C基因水稻田的土壤中，Bt蛋白的含量均随着时间的延长而降低，其原因可能是随着时间的延长，土壤中的Bt蛋白逐渐发生降解。3种后茬作物的种植对土壤各层的Bt蛋白含量无显著影响，说明测试的3种后茬作物对土壤中Bt蛋白的降解没有显著的作用。1月份和3月份转cry2A基因水稻田以及1月份转cry1C基因水稻田采集的表层土样中的Bt蛋白含量显著高于地下10 cm和地下20 cm土壤中的含量，地下2层土样中的Cry2A蛋白含量之间无显著差异，可能是因为残留水稻秸秆的分解导致表层Bt蛋白含量高于地下。3月份转cry1C基因水稻田以及6月份转cry2A基因水稻田和转cry1C基因水稻田的土壤中Bt蛋白的含量均不受土壤深度的影响，原因可能是Bt蛋白的降解基本完成，含量达到了稳定状态。

有关Bt作物的种植对蚯蚓生长和繁殖的研究已有很多，Ahl-Goyetal.(1995)将Bt玉米粉碎后加入土壤中饲养蚯蚓，在蚯蚓的肠道和粪便中均能够检测到Bt蛋白，但Bt蛋白对蚯蚓没有急性致死效应。Ahmadetal.(2006)将Bt玉米的秸秆粉碎后加入到种植过Bt玉米的土壤中，发现其对蚯蚓的死亡率和体重变化无显著影响。崔蕾等(2014)发现，转cry1Ie基因玉米残体对赤子爱胜蚓的体重、产茧量和茧的孵化率没有不利影响。Schraderetal.(2008)认为，蚯蚓能够促进Bt蛋白的降解，但Bt蛋白对蚯蚓无不良影响。Vercesietal.(2006)的研究表明，在室内设定的转cry1Ab基因玉米最高Bt蛋白浓度(5 g·kg-1干土)条件下饲喂Aporrectodeacaliginosa，对其幼蚓的存活和成蚓的生长和繁殖无显著影响。本研究通过在室内条件下用田间采集的土样饲养蚯蚓4周和7周，结果表明，无论是饲养4周还是7周，种植过转Bt基因水稻后的土壤对蚯蚓的率和死亡率与对照相比无显著差异，在2种Bt蛋白最高浓度的条件下和对照相比对蚯蚓的存活率没有不利影响，表明田间Bt蛋白的含量不足以对蚯蚓产生影响。

有关Bt作物对蚯蚓体内酶活性的研究已有较多报道，但大多数研究集中于Bt玉米和Bt棉花中(崔蕾等，2014； 舒迎花等，2011； 肖能文，2005； Liuetal.，2009)，均表明其对蚯蚓体内的总蛋白含量、CAT、AChE和SOD酶的活性没有显著影响。而有关转Bt基因水稻种植对蚯蚓酶活性的研究则较少。本试验测定了用种植过转Bt基因水稻的土壤处理4周和7周后的蚯蚓体内的总蛋白含量和2种解毒酶AChE和GSTs活性，结果表明，用种植转Bt基因水稻过后的土壤饲养赤子爱胜蚓，其体内的总蛋白量以及AChE和GSTs的活性与对照相比没有显著差异。

综合上述内容，种植过转Bt(cry2A和cry1C)基因水稻的土壤对赤子爱胜蚓的生长发育和繁殖没有不利的影响，对其体内相关的解毒酶以及总蛋白含量亦无显著的影响。Bt蛋白随时间的延长而逐渐降解，水稻收割初期，土壤表层Bt蛋白含量显著高于地下土层中的含量。后茬作物的种植对土壤中Bt蛋白的含量没有影响。Bt蛋白在土壤中存在时间较长，而且会有一定的积累过程，因此需要进一步更长时间的研究来确定其对地下非靶标生物的影响。后茬作物是否存在对Bt蛋白的吸收亦需要进一步对后茬作物的检测。

致谢:感谢浙江省金华市植物保护站陈桂华、张发成和朱平阳对本研究在田间管理和取样过程中的帮助；感谢浙江省农业科学院农产品质量标准研究所王彦华博士提供蚯蚓并技术指导。

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(责任编辑:郭莹)

Effect of soil planted withBtrice on the development and enzyme activities ofEiseniafoetida

kai LIU1,2, Ya-jun YANG1, Jun-ce TIAN1, Yan-hui LU1, Hong-xing XU1,Xu-song ZHENG1, Zhong-xian LÜ1,2*

1InstituteofPlantProtectionandMicrobiology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou,Zhejiang310021，China;2CollegeofChemistryandLifeScience，ZhejiangNormalUniversity,Jinhua,Zhejiang321004,China

【Background】 The safety associated with planting transgenic crops remains a concern for the public. Study on the effect of Bt proteins on the underground non-target organisms is an important part for the safety evaluation of transgenic crops. 【Method】 In this study, pea, alfalfa, and rape were planted as after-reap crops in the experimental field, where transgenicBtrice was previously grown. In the field, soil samples were collected in January, March, and June of 2013 and used to cultivateEiseniafoetidain laboratory conditions. At weeks 4 and 7, we determined the development and enzymatic activities ofE.foetida. The contents of Bt protein in soil samples at different depths were determined and the survival rate ofE.foetidafeeding with Bt protein directly was evaluated. 【Result】 The soil samples collected from the plotd planted with transgenicBtrice T1C-19 and T2A-1 had no significant effects on the development, survival rate and enzymatic activities ofE.foetidacompared with soil samples collected from plots planted with the non-transgenicBtrice MH63. Samples of the surface soil showed significantly higher levels of Cry2A protein in in January and March and of Cry1C protein in January than soil collected in deeper. There were no significant differences in the amounts of Cry2A Bt protein in 10 cm and 20 cm as well as soils collected from T1C-19 plot in March and June and T2A-1 plot in June. Dynamics of Bt protein were not affected by the after-reap crop in this study. The survival rates ofE.foetidadirectly fed with Cry2A and Cry1C proteins were 96.7% and 95.0%, and did not significantly differ from the control. 【Conclusion and significance】 Our results indicated that the planting of transgeniccry2Aandcry1CBtrice had no significant difference on the development and enzyme activities ofE.foetida. Our study provides some basic protocol for evaluating the safety of transgenic rice.

transgenicBtrice; afterreap crop; contents of Bt protein in soil samples;Eiseniafoetida; growth rate; mortality; enzyme activity

2015-04-19 接受日期(Accepted)： 2015-05-13

国家转基因生物新品种培育重大专项(2014ZX08001-001)； 国家水稻产业技术体系(CARS-01-17)

刘凯， 男， 硕士研究生。 研究方向: 水稻害虫综合治理。 E-mail: liukai5088@126.com

*通讯作者(Author for correspondence), E-mail: luzxmh2004@aliyun.com

10.3969/j.issn.2095-1787.2015.03.008