白 阳, 孙正旺,2, 刘春莹, 鱼红闪, 孙长凯, 金凤燮

甘草总黄酮的制备及其抗皮肤老化功能

白 阳1, 孙正旺1,2, 刘春莹1, 鱼红闪1, 孙长凯3, 金凤燮1

(1.大连工业大学生物工程学院,辽宁大连 116034; 2.韩国庆熙大学生命科学学院,韩国京畿道 446-701; 3.大连医科大学脑疾病研究所,辽宁大连 116044)

研究了甘草植物各部位的甘草总黄酮分布和药渣中甘草总黄酮的提取方法,并探索了甘草总黄酮对皮肤细胞的毒性及其抗老化功能。结果表明,甘草植物各部位中甘草总黄酮的含量分布由多到少依次是叶、根、果实、茎。从甘草根药渣中可提取3%的总黄酮,接近于甘草直接提取总黄酮的量。甘草总黄酮的质量浓度在1和10μg/m L时,皮肤细胞正常生长,但在100μg/mL时,细胞存活量低于25%,说明高浓度的甘草总黄酮抑制细胞生长。甘草总黄酮明显抑制UVB导致的皮肤细胞胶原蛋白分解酶(MMP-L1)的生成,甘草总黄酮质量浓度在1和10μg/mL时,将MMP-L1的生成分别降低23%和56%,说明其具有抗皮肤老化功能。

甘草总黄酮;细胞毒性;抗老化

0 引 言

甘草的主要成分是甘草皂苷[1]和甘草黄酮。甘草总黄酮具有良好的抗炎、美白、保护皮肤的功能[2],是化妆品的绿色添加剂。康金森等[3]给小白鼠腹腔注射甘草总黄酮,检测实验鼠肝脏组织中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及皮肤组织中的SOD、MDA的变化,证明了甘草总黄酮的皮肤抗老化功能。

本实验研究了甘草植物的根、茎、叶和种子中的甘草总黄酮分布、甘草根提取甘草皂苷后的药渣中甘草总黄酮的提取方法及甘草总黄酮的皮肤细胞毒性。UVB照射人正常皮肤成纤维细胞,会诱导胶原蛋白分解酶的生成[4],同时研究了甘草总黄酮抑制胶原蛋白分解酶生成的方法及甘草总黄酮对皮肤细胞的抗UVB和抗老化功能,以期为甘草总黄酮在功能化妆品中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

新疆乌拉尔甘草,薄层层析硅胶板(Silica gel 60 F254),人正常皮肤成纤维细胞(NHDF),细胞DMEM培养基,胎牛血清(FBS),青霉素/链霉素,MTT试剂,二甲基亚砜,测定胶原蛋白分解酶(MMP-L1)的免疫ELISA试剂盒。

1.2方法

1.2.1 测定甘草植物各部位的甘草总黄酮分布

取甘草根、茎、叶、种子各10 g,捣碎,分别加入8倍体积的80%乙醇,常温浸泡24 h,离心收集上清,再用5倍体积的80%乙醇提取2次,合并3次提取液,减压浓缩,干燥,乙酸乙酯萃取至无黄酮(TCL检测),减压浓缩、干燥得甘草总黄酮,精密称重[5]。该实验重复3次。

1.2.2 甘草渣中提取甘草总黄酮

取500 g切好的甘草根,加入6倍体积的水,在50℃提取4 h,重复3次,合并提取液,上样于1 000 m L的AB-8树脂柱中吸附皂苷,用6倍柱体积的水洗柱除掉糖类,再用80%乙醇洗柱洗脱皂苷,洗脱液减压浓缩、干燥得甘草皂苷。

提取皂苷后的甘草药渣中,甘草根部药渣分别用600,400,200 m L的80%乙醇浸泡24 h,将3次乙醇浸提液混合,离心、上清液减压浓缩,得甘草总黄酮粗品,粗品用乙酸乙酯萃取后,溶液减压浓缩,干燥得米黄色的甘草总黄酮[6]。

1.2.3 薄层层析(TLC)法检测甘草总黄酮

利用展开剂(乙酸乙酯、丁酮、甲醇、水的体积比为10∶7∶1∶1)展开,置于暗箱式紫外分析仪(274 nm)观察检测,并以标准品芦丁黄酮为对照。

1.2.4 甘草总黄酮对皮肤细胞的毒性和抗老化功能

当紫外线照射MHDF细胞时,会诱导胶原蛋白分解酶的生成。参照Hwang[7]的方法,加入不同浓度的甘草总黄酮对细胞生长和胶原蛋白分解酶的生成产生抑制[8],确认其对细胞的毒性和抗皮肤老化功能。

1.2.4.1 细胞培养

MHDF细胞接种到装有DMEM培养基的100 mm的细胞培养皿,放入含5%CO2的细胞培养箱中,在37℃培养。传代培养6～10代,得到细胞浓度较好的培养液用于实验。

1.2.4.2 UVB照射与样品处理

将培养的细胞(约1.2×105个)接种到40 mm的细胞培养皿中,培养24 h,待细胞生长至占据培养皿面积80%的时候,吸去培养基,PBS洗一遍,然后加入300μL PBS,用透明膜封口,UVB照射细胞40 s,照射剂量为144 mJ/cm2,照射后立即用300μL PBS再洗一遍,分别接种到含有甘草黄酮0(对照),1,10,100μg/m L的培养液(2 m L/平皿)中,在37℃培养72 h。其中1 m L培养液,用于抑制MMP-L1生成的测定,剩下1 m L用于细胞存活力的测定。该实验重复3次。

1.2.5 细胞存活力

在1 mL的培养液中加入100μL的1 mg/mL的MTT,培养2 h,将培养液溶于DMSO中,振荡10 min,测定570 nm吸光度,得到细胞存活力。

1.2.6 甘草总黄酮抑制胶原蛋白分解酶的生成

利用免疫ELISA试剂盒测定1 m L培养液中的胶原蛋白分解酶生成量。

2 结果与讨论

2.1甘草各部位甘草总黄酮的分布

甘草叶中总黄酮含量最高,为4.6%;其次为甘草根,为3%。甘草果实和茎中总黄酮含量分别2%和0.85%。所提取的甘草总黄酮和对照芦丁黄酮一样,在紫外线274 nm下,有明显斑点,说明是黄酮类。

2.2甘草根中的甘草皂苷和总黄酮提取

500 g甘草根经提取,得到46 g甘草皂苷,甘草根中的皂苷质量分数在9%以上,但甘草茎叶中的甘草皂苷含量较低。提取甘草皂苷后的药渣,得到甘草总黄酮15.3 g,得率为3%,接近于甘草根直接提取总黄酮的量,说明先提取甘草根中的甘草皂苷,再提取药渣中的甘草总黄酮的方法可行,提取结果如图1所示。

2.3甘草总黄酮的细胞毒性

从图2中可以看到,甘草总黄酮质量浓度为1和10μg/m L时,细胞生长正常。但是甘草总黄酮质量浓度为100μg/m L时,细胞存活量低于25%,说明甘草总黄酮对细胞有毒性。因此,甘草总黄酮用于化妆品时,应控制其添加量。

图1 甘草各部位提取的总黄酮的TLC结果Fig.1 TLC result of total flavonoids extracted from various parts of the licorice

图2 甘草总黄酮质量浓度对细胞存活量的影响Fig.2 Effect of licorice flavonoids concentration of cell viability

2.4甘草总黄酮对胶原蛋白分解酶生成的抑制

从图3中可以看到,细胞受到UVB照射时,明显地生成胶原蛋白分解酶,MMP-L1酶蛋白质量浓度从0.03μg/m L增加到0.18μg/m L。加入甘草总黄酮质量浓度为1μg/m L时,MMP-L1酶蛋白质量浓度降至0.14μg/m L,降低了23%。当甘草总黄酮质量浓度为10μg/m L时, MMP-L1酶蛋白质量浓度降至0.08μg/m L,降低了56%。说明甘草总黄酮明显地抑制UVB引起的人体皮肤细胞胶原蛋白分解酶的生成,也就是甘草总黄酮会提高人体皮肤细胞抗UVB功能。

图3 甘草总黄酮质量浓度对胶原蛋白分解酶的抑制Fig.3 Effect of licorice flavonoids concentration on collagen hydrolase inhibition

3 结 论

用乙醇提取法测定甘草各部位黄酮的质量分数,由高到低依次为叶4.6%,根3.0%,果实2.0%,茎0.85%。从甘草根提取皂苷后的药渣中提取总黄酮得率为3.0%左右,接近于甘草根中直接提取总黄酮的量,说明此方法可行,对甘草加工行业有一定的意义。

当甘草总黄酮质量浓度达到100μg/m L时,细胞存活量低于25%,明显抑制细胞生长,对细胞有毒性,说明甘草总黄酮在化妆品中添加时不亦过多,在1和10μg/m L时细胞毒性小。当甘草总黄酮浓度为1和10μg/m L时,将皮肤细胞的胶原蛋白分解酶的生成分别降低23%和56%,说明甘草总黄酮明显抑制UVB导致的皮肤细胞胶原蛋白分解酶的生成,具有皮肤抗老化功能。

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Preparation of licorice flavonoid and its anti-skin-aging function

BAI Yang1, SUN Zhengwang1,2, LIU Chunying1, YU Hongshan1, SUN Changkai3, JIN Fengxie1
(1.School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 2.College of Life Science,Kyung-Hee University,Yong-si 446-701,Korea; 3.Institute for Brain Disorders,Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

The distribution and extraction of licorice flavonoids in liquorice were studied,and their toxicity against skin-cells and anti-skin-aging activity were determined.The descending content of licorice flavonoids in liquorice was leaf,root,fruit and stem.3%of licorice flavonoids could be extracted from the root residue,which was close to that from root.The normal growth of skin cells were observed when the licorice flavonoid concentration was 1 and 10μg/m L,but only 25%of active skin cells were obtained when the concentration was 100μg/m L.Licorice flavonoids inhibit the formation of collagen-protein-hydrolase induced by UVB.Its production was decreased by 23%and 56%respectively when flavonoids content was 1 and 10μg/m L,suggested that it had the anti-skin-aging function.

licorice flavonoids;toxicity to skin-cells;anti-aging

TS201.2;R283.6

:A

文章编号:1674-1404(2015)05-0317-03

2014-11-10.

“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX09503001-003).

白阳(1989-),女,硕士研究生;通信作者:金凤燮(1945-),男,教授.