刘永刚,姜 凤,姜尧佳

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154003)

高血压性脑出血周围脑组织超微结构及脑水肿发生机制研究*

刘永刚,姜 凤,姜尧佳

(佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154003)

目的: 高血压性脑出血后周围脑组织超微结构变化，基质金属蛋白酶 2, 9(MMP-2, MMP-9) 表达在高血压性脑出血后(早期)脑水肿发生中的作用。方法: 应用免疫组织化学方法检测高血压性脑出血患者出血后6h, 12h,24h,48h,72h,120h,1W,2W 血肿周围脑组织中MMP-2、MMP-9 的表达，透射电镜下观察，血肿周围脑组织超微结构变化。结果: 研究表明在高血压性脑出血患者血肿周围有脑水肿发生, 正常对照组中未发现明显的 MMP-2, MMP-9 阳性表达, 而在高血压性脑出血组出血24 h内MMP-2 及 MMP-9 则见明显表达(P<0.01)。结论:MMP-2 及MMP-9 在脑出血患者血肿周围脑组织的表达增高与高血压性脑出血后脑水肿的发生具有密切的关系。

脑出血;脑水肿;超微结构;发生机制

脑出血后常见的继发性损害是血肿周围脑组织发生水肿,这可能与脑出血后，血肿周围脑组织发生缺血、伴有炎症反应等有关。而脑组织水肿可以使颅内压增高，极易发生脑疝，导致患者死亡。其中MMP-2和MMP-9表达以及活性升高,降解细胞外基质，从而使血脑屏障(bloodbrainbarry,BBB)破坏,使脑微血管通透性及BBB通透性增加,造成出血周围脑组织水肿以及神经细胞损伤。有研究表明,MMP-9在表达上的增多，是导致脑出血后脑水肿形成重要原因之一;而MMP-2在表达上的增多，可能在出血后早期脑水肿(24h内) 的形成起重要作用。故本研究选取高血压性脑出血患者为研究对象,探讨脑出血后脑组织中基质金属蛋白酶2(matrixmetalloproteinase-2,MMp-2)及基质金属蛋白酶9m(atrixmetalloporteinase-9,MMp-9)表达增高在脑水肿发生中所起作用,从而为患者的临床治疗提供更加切实可行的方案。

1 资料与方法

1.1 一般资料

取30例佳木斯大学附属第一医院2011-06～2012～09高血压性脑出血患者，急诊行头颅CT检查，行开颅去骨瓣减压术后，取血肿周围脑组织作标本。男20例,女10例;年龄46～72岁。因无法从正常脑组织取材，以10例原发性癫痫病人手术切除癫痫灶处脑组织标本作为正常对照组。

1.2 方法

1.2.1 标本处理：病理切片的制作及主要试剂：取脑组织在10%福尔马林中固定72h, 作冠状切片, 厚约5mm，以石蜡包埋, 连续切片作MMP- 2、MMP- 9免疫组化染色。每张切片随机选取不重复4个视野, 放到光学显微镜下(10×40倍)，计数MMP- 2阳性表达细胞数量、及MMP- 9阳性表达微血管数量, 算出平均MMP- 2阳性表达细胞数量、MMP- 9阳性表达微血管数量。MMP- 2、MMP- 9 免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2.2 采用干湿重法测定脑组织含水量：取材厚度3mm脑出血侧脑组织测定湿重A, 然后在95℃烘箱中烘24h称干重B,脑组织含水量的计算公式为：( 湿重A- 干重B) / 湿重A×100%, 数值精确到 0.1mg。

1.2.3 透射电镜：取脑血管组织标本，剪成lmm×lmm×lmm大小，以戊二醛固定;然后用0.lPBS缓冲液漂洗15min，共4次;再以1%饿酸固定1.5h;用0.1mmol/LPBS缓冲液洗15min，共4次; 50%丙酮15min，1次;70%丙酮15min，1次;90%丙酮15min，1次;100%丙酮15min，共3次;纯丙酮/树脂l:1lh;纯丙酮/树脂1: 2 2h;纯树脂包埋过夜;修块机修块定位，然后经超薄切片机切片，将切片捞片置于铜网上;醋酸铀及拘椽酸铅染色,观察结果。透射电镜(JEM-1200EX,Japan)观察。

1.3 统计学方法

采用单因素方差分析(one-way,ANONA) , 多个样本均数之间的两两比较采用q检验。以均数±标准差表示MMP- 9 阳性微血管数与脑组织含水量之间采用直线相关分析。

2 结果

2.1 脑出血后水肿周围组织含水量的变化情况

脑出血周围脑组织含水量变化趋势，在脑出血 12h明显增加(P<0.05), 72h达到峰值(P<0.01), 2w与假手术对照组无明显差别 (P>0.05)。见表1。脑出血后MMP-9 的表达与脑组织含水量之间密切相关。脑出血后MMP-9 阳性微血管数增高，脑组织含水量增加，二者的变化趋势大体相同。

表 1 不同时间MMP-2,MMP-9表达阳性细胞数及脑组织含水量的变化±s)

2.2 光镜(HE染色)

见图1～4。

图1MMP-9在对照组表达 ×200 图2MMP-9在脑出血组表达×200 图3MMP-2在对照组表达×200 图4MMP-2在脑出血组表达×200

图5 脑组织细胞肿大 图6 胞浆呈空泡样 图7 细胞发生变性、坏死

2.3 透射电镜

结果表明出血周围脑组织血管内皮细胞肿大,伴有血脑屏障破坏,血管外红细胞数明显增多,血管周围呈"空泡样"。微血管管壁厚薄不均,内膜下层较不完整,内皮细胞间紧密连接受到破坏,中性粒细胞紧紧贴附于血管壁(图5～7)。脑组织细胞肿大,胞浆呈空泡样,部分细胞发生变性、坏死,细胞内细胞核固缩,细胞核核膜下染色质聚集一起。

3 讨论

关于脑出血后脑水肿的研究比较关注于凝血酶的作用，以及应用凝血酶抑制剂的影响,细胞因子在水肿形成中的作用等实验研究。而对于脑出血后脑水肿临床性的试验研究相对较少。本实验对脑出血患者脑出血后24h内血肿周围脑组织超微结构变化、MMP-2 与MMP-9 在不同时间的表达进行研究, 了解其在高血压性脑出血后早期脑水肿中所起作用。我们发现在血肿周围脑组织MMP- 9表达明显增多, 发生在脑出血后6h，并且持续存在，在48h后达峰值, 而在2周后表达则明显减少，几乎为零。脑出血后MMP- 2表达显著增多，出现在48h, 在出血120h达到峰值, 可持续较长时间。MMP- 2主要在巨噬细胞表达，Romanic等曾进行大脑中动脉局灶性脑缺血/再灌注的实验，其实验结果与我们是一致的的[1]。本实验还显示脑出血后MMP-9的表达增多，脑出血后脑组织含水量明显增加，此二者时程上呈正相关。我们认为血肿边缘内皮细胞对MMP-9的表达，可使脑出血后脑水肿加重，从而促使白细胞游出浸润。研究表明内皮细胞能够分泌MMP-9,通过释放MMP-9,,从而降解基底膜, 破坏血脑屏障，使血脑屏障更易通透,导致血肿周围的脑组织含水量明显增加。在研究中我们发现中性粒细胞表达MMP-9, 发生在脑出血后 12～24h，24h后中性粒细胞以及巨噬细胞通过表达MMP- 9, 使其游出于血管外, 到达血管外脑组织后，释放出血管活性胺，细胞因子等介质,导致脑组织发生继发性损害,从而使脑水肿进一步加重[3，4]。Rosenberg[2]等用胶原酶法制作脑出血模型试验表明,MMP- 9及脑组织含水量显著增多, 发生于脑出血后24h，而通过MMP-9 抑制剂BB1101的使用, 可使脑组织含水量明显减少, 但对于24h以后的脑水肿无明显缓解, 说明MMP- 9 致出血周围脑组织发生脑水肿，前期阶段是由血脑屏障开放引起,后期阶段则是由于巨噬细胞和中性粒细胞释放血管活性胺，细胞因子等炎症介质所引起的。所以我们在脑出血早期阻断MMP- 9 的激活, 会减少脑出血后脑组织的水肿，从而避免颅内压的增高，以及脑疝的发生。MMP-2 主要在巨噬细胞表达,在第5天达峰值, 而此时是脑组织损伤的修复阶段[5]。我们发现血液中存在巨噬细胞，其能够表达MMP- 2, 有利于巨噬细胞通过血管壁， 其可以吞噬细胞碎片以及坏死的机体组织, 起到修复损伤脑组织的作用。研究表明,MMP-2、MMP-9 在脑出血后脑水肿形成，脑组织损伤及损伤脑组织的修复具有重要的作用, 这将对于出血性脑血管病的预防及治疗提供有利的支持。

[1]AMRomanic,RFWhite,AnthonyJ,etal.Matrixmetallopro-teinaseexpressionincreasesaftercerebralfocalischemiainrats.Inhibitionofmatrixmetalloproteinase- 9reducesinfarctsize[J].Stroke, 1998, 29: 1020-1030

[2]RosenbergGA,NavratilM.Metallopriteinaseinhibitionblocksedemainintracerebralhemorrhageintherats[J].Neurology,1997,48(4):921-926

[3]WeissSJ,PeppinGJ.Collagenolyticofthehumanneutrophil[J].BiochemPharmacol，1986, 35:3189-3197

[4]UnimoriEN,BouhanaKS,WerbZ.Vectoralerectionofextra-cellularmatrixproteins,matrix-degradingproteinasesandtissueinhibitorofmetalloproteinasesbyendothelialcells[J].JBiolChem,1990,265:445-451

[5]RosenbergGA,EstradaEY,DencoffE.Matrixmetallopro-teinasesandTIMPsareassociatedwithblood-brainbarrieropeningafterreperfusioninratbrain[J].Stroke, 1998, 29:2189-2195

黑龙江省卫生厅科研课题项目，编号：2011-380；佳木斯大学科学技术校级面上项目，编号：S2011-028。

刘永刚(1973～)男, 黑龙江绥滨人，硕士，副主任医师。

姜尧佳(1976～)男，黑龙江佳木斯人，硕士，主治医师。E-mail:jyj761024@163.com。

R544.1；R

B

1008-0104(2015)02-0142-02

2014-12-13)