李 丽，王长山，康晓明，王显鹤，孟庆云

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

肾病综合征大鼠血清IL-4和IL-12的动态变化及其意义①

李 丽1，王长山2，康晓明1，王显鹤1，孟庆云1

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007)

目的：本实验通过微小病变型肾病综合征模型(MCNS)，观察血清IL-4、IL-12的动态变化，探讨MCNS的免疫学发病机制。方法：将40只大鼠随机分为正常组、肾病组，每组20只。阿霉素5mg/kg制MCNS模型。观察大鼠一般情况，检测24h尿蛋白、血清白蛋白和总胆固醇水平，用ELISA检测血清IL-4、IL-12的水平。结果：与正常组比较，肾病组出现大量的蛋白尿，低白蛋白血症，高胆固醇血症和明显的水肿，血清IL-4升高，IL-12降低。结论：①MCNS存在TH1/TH2功能紊乱，IL-4、IL-12参与了MCNS的免疫机制。

大鼠；微小病变型肾病综合征；IL-4；IL-12

肾病综合征(Nephrotic Syndrome，NS)是小儿时期常见疾病之一，其病因和发病机制虽然大量进行研究，迄今尚未阐明。研究肾脏疾病中TH1与TH2的平衡，在于更深入理解疾病免疫发病机制。近年来，细胞因子与肾脏疾病关系的研究一直是令人关注的研究领域，IL-4作为TH2细胞因子，IL-12作为TH1细胞因子，其在肾脏疾病的发病机制也引起了国内外学者的兴趣，尤其在微小病变型肾病综合征中[1，2]。研究表明，MCNS与T细胞免疫功能紊乱有关[3]，细胞免疫在NS发病机制中发挥着重要的作用[4，5]。本实验通过微小病变型肾病综合征模型(MCNS)，观察血清IL-4、IL-12的动态变化，探讨NS免疫学发病机制，为NS的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

阿霉素(购于浙江海正药业股份有限公司)； ELISA试剂盒(IL-4和IL-12，USA生产，购于大连泛邦技术开发有限公司)；考马斯亮蓝(购于南京建城公司)。其它：生理盐水、乙醇、注射用水、龙胆紫、双蒸水等。

1.2 方法

1.2.1 实验动物与分组

6周龄雄性清洁级Wistar大鼠40只，体重(120±20)g，两次尿蛋白定性试验阴性，由佳木斯大学实验动物中心提供，在实验过程中大鼠被饲养在12h白天，12h黑夜，温度21～22℃，湿度50%～70%的标准环境中，均自由食用动物中心提供的饲料和自来水。分组40只大鼠随机分为二组，即正常组20只、肾病组20只。

1.2.2 阿霉素大鼠模型制作

在临用时将注射用阿霉素用生理盐水稀释2mg/mL溶液。大鼠固定，一次性尾静脉注射阿霉素5mg/kg。对照组同种方法注射5mg/kg生理盐水。

1.2.3 标本留取

各组大鼠在1周、2周、4周时将置于代谢笼中，留取24h尿液；乙醚实施麻醉下于2周、4周采血，分离血清，-20℃冰箱保存；4周时取肾组织，行HE染色。

1.2.4 观察指标及检测方法

动态观察大鼠情况：记录饮水量、尿量和体重情况，精神状态、毛发及色泽、水肿和大鼠活动情况。

24h尿蛋白的检测：采用721分光度计，将24h尿液，利用BBC即考马斯亮蓝法，进行检测。

血生化检测：血清白蛋白和总胆固醇采用全自动生化分析仪一次性进行检测。

白细胞介素IL-4、IL-12和的测定：严格按照说明书进行操作。具体步骤：试剂盒置于室温，取出反应板；分别加入20μL标准品和血清，每孔放入100μL抗大鼠IL-4Biotin或抗大鼠IL-12Biotin，混匀，封板孔，室温放置半小时；洗板，洗涤5次；加入每孔150μL抗大鼠IL-4POD或抗大鼠IL-12POD，混匀，封板，室温半小时。洗板，加入每孔100μL显色液，混匀，室温温育20min。加入终止液，混匀；半小时内在450nm处读OD值，绘标准曲线。根据血清样品的OD只可在标准曲线上查出其浓度。

肾脏形态学检查：外观观察和光镜下观察：将肾脏取出后观察外观情况以及HE染色后光镜下进行观察。HE染色如下：恒温箱60℃连续烤片1h,常规脱蜡至水。苏木素染色10min,0.5%盐酸酒精分化10～30′，流水蓝化10min。伊红染色5min，自来水冲洗2min。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 大鼠一般状况观察

对照组大鼠活动自如，正常进食，饮水量和尿量无减少，无水肿，毛色光泽。

肾病组4～5d部分大鼠出现轻度腹泻，倦缩供背，活动减少；肾病组2周后大鼠被毛蓬松，失去光泽，精神烦躁，阴囊及颜面水肿，饮水及进食量略减少；肾病组大鼠4周后活动迟缓，进食及饮水量明显减少，被毛无光泽，尿量减少，足部及阴囊水肿明显，多只出现腹水。

2.2 各组大鼠不同时间点24h尿蛋白动态变化

注射阿霉素后1周末，肾病组大鼠出现蛋白尿，以后持续加重，至第4周达高峰。与正常组比较，肾病组尿蛋白高于正常组，差别有显著性(P<0.01)，见表1。

表1 实验大鼠24h尿蛋白定量

※※与正常组比较P<0.01。

2.3 各组大鼠血清生化指标动态变化

与正常组比较，肾病组各时间点血清白蛋白均低于正常组，差别有显著性(P<0．01)；肾病组各时间点血清总胆固醇均高于正常组，差别有显著性(P<0．01)，见表2。

表2 各组大鼠血清白蛋白和血清总胆固醇的变化±s)

※※与正常组比较P<0.01。

2.4 各组大鼠血清IL-4与IL-12的动态变化

与正常组比较，肾病组血清IL-4水平各期均明显高于正常组，差别有显著性(P<0．01)。与正常组比较，肾病组血清IL-12低于正常组，差别有显著性(P<0．01)，见表3。

表3 各组大鼠血清IL-4和IL-12的含量变化

※※与正常组比较P<0.01。

2.5 形态学观察

肉眼观察：正常组肾脏红润无腹水，肾病组肾脏较正常组肿大，包膜紧张，颜色淡而少光泽，部分腹腔内有积液。

光镜观察：正常组肾小球结构正常，毛细血管无淤血，肾小管腔内未见管型；肾病组可见肾小球毛细血管淤血，肾小管腔内有大量均匀红染的蛋白管型；如图1。

正常组(×400) 肾病组(×400)

3 讨论

本实验结果显示，肾病组大鼠血清IL-4明显高于正常组，且随着病情进展而呈持续升高，这说明TH2型细胞占优势，这与周发为等[7]人的报道结果一致，TH2型细胞增多，促进了IL-4的产生，从而促进了TH0细胞向TH2细胞转化，抑制向TH1细胞转化。IL-4的增高同尿蛋白增高呈一致性。这与范兴忠等人[8]的结果相符。肾病大鼠血清IL-12低于正常组，且在阿霉素注射2周末明显降低，而4周末为最低，这说明TH1型细胞减少，使之分泌IL-12降低，由于IL-12不足对TH1的支持减弱，而IL-4水平增高，诱导TH2功能，最终导致了TH1/TH2细胞功能失衡。因此，我们认为TH1/TH2细胞免疫功能失衡在微小病变型肾病综合征中发挥着重要作用，而IL-4、IL-12参与了微小病变型肾病综合征的免疫发病机制。

[1]李丽，王长山，孟庆云，等. 卡介菌多糖核酸对肾病大鼠血清IL-4和IL-12的影响[J]. 黑龙江医药科学，2012，35(2):31-33

[2]IkeuchiY,KobayashiY,ArakawaH,etal.Polymorphismsininterleukin-4-relatedgenesinpatientswithminimalchangenephroticsyndrome[J].PediatrNephrol，2009，24(3):489-495

[3]MiyazakiK,MiyazawaT,SugimotoK,etal.Anadolescentwithmarkedhyperimmuno-globulinemiaEshowingminimalchangenephroticsyndromeandaSTAT3genemutation[J].ClinNephrol，2011，75(4):369-373

[4]HuGH,YiZW,WangJH,etal.EffectoftriptergiumwilfordiipolyglycosidiumoncontentofTh1andTh2inchildrecurrentnephroticsyndrome[J].ZhongguoZhongYaoZaZhi，2008，33(4):441-443

[5]LeBerreL,HervéC,BuzelinF,etal.RenalmacrophageactivationandTh2polarizationprecedesthedevelopmentofnephroticsyndromeinBuffalo/Mnarats[J].KidneyInt，2005，68(5):2079-2090

[6]江晓东，陈惠晓.TH细胞的分化调控[J].国外医学免疫学分册，2003，26(2)：79-82

[7]周发为， 游文忠， 覃仕锋，等. 小儿激素敏感型肾病综合征血清中IL-4、IL-5、TGF-β与IL-10水平变化及意义[J].中国免疫学杂志，2014，30(5)：673-676

[8]范兴忠，李宏，刘文峰，等.肾病综合征患者血清IL-4和IL-10水平的变化及意义[J].免疫学杂志，2010，26(1)：56-57

Dynamic changes and significance of serum levels of IL-4 AND IL-12 in rats of nephrotic syndrome

LILi1,WANGChang-shan2,KANGXiao-ming1,WANGXian-he1,MENGQing-yun1

(1.The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China; 2.College of Basic Medical Sciences of Jiamusi University, Jiamusi 154007, China)

Objective: To observe developing changes of serum value IL-12, IL-4 in rats by using minimal change nephrotic syndrome (MCNS); and to discuss MCNS immunopathogenesis.Methods: Forty wistar rats were randomly divided into normal group, nephritic group with 20 rats in each group. MCN models were induced by adriamycin at a dose of 5mg/kg. Each group’s normal conditions were observed. 24h urinary protein, serum albumin and serum total cholesterone were measured. IL-4, IL-12 serum level were measured with ELISA Results: there were quantitative proteinuria, hyperlipidemia, hypoalbuminemia and evidence edema in nephritic group compared with normal group. the serum il-4 level was higher, but serum IL-12 level was lower in nephritic group than those in normal group. Conclusion: Th1/Th2 functional imbalance exists in patients with MCNS. IL-4 and IL-12 are involved in the immunologic mechanisms.

rat; minimal-change nephrotic syndrome; Interleukin-4; Interleukin-12

黑龙江省青年科学基金项目，编号：QC2012C119；黑龙江省卫生厅科研项目，编号：2012-198；佳木斯大学科学技术重点项目，编号：Sjz 2014-011。

李丽(1979～)女，黑龙江佳木斯人，博士，副教授，副主任医师，硕士研究生导师。

王长山(1977～)男，黑龙江佳木斯人，博士，副教授，硕士研究生导师。E-mail: wcs0451@163.com。

R692

A

1008-0104(2015)02-0012-03

2014-09-05)