周 洲， 李永丽， 源春彦， 安世恒， 尹新明

(1．河南科技大学林学院，河南 洛阳 471003;2.河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002)



欧美杨POR组培再生系统研究

周 洲1， 李永丽1， 源春彦1， 安世恒2， 尹新明2

(1．河南科技大学林学院，河南 洛阳 471003;2.河南农业大学植物保护学院，河南 郑州 450002)

以欧美杨POR(Populus×euramericana)幼嫩茎段、叶片2种外植体为材料，研究诱导不定芽、茎伸长和生根的合适培养条件。结果表明，TDZ在芽诱导过程中有显著的促进作用，不定芽诱导最适培养基为MS+TDZ 0.05 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，茎段和叶片分化率分别为97.3 %和88.6 %；丛生芽的茎伸长诱导最适培养基为MS+KT 0.5 mg·L-1+GA31 mg·L-1+果糖30 g·L-1，茎段和叶片来源的丛生芽的茎伸长率分别为95.5%和90%，茎伸长培养20 d，每个外植体超过3 cm的芽有3个以上。抽茎芽可直接转入生根培养基，在培养基1/2 MS+IBA 0.05 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1中生根率可达92.2%，生根数量多，苗体健康。

欧美杨POR；离体培养；芽伸长；生根

欧美杨POR(Populus×euramericana)属于黑杨派，由葡萄牙选育，1995年引入中国，经过多年栽培试验、示范和推广，非常适宜中国华北中原地区种植。该品种在生长速度、抗病虫害能力及成材质量等方面都非常优越，可作为营造工业用材和造纸用材的商品林；耐旱性、耐寒性、杆形通直美观，也是改善生态环境及营造速生丰产林的的首选树种，已被国家林业总局列为中国华北地区重点推广的树种之一[1,2]。中国的杨树基因转化研究已经取得了许多成果，为了使一些成功的理论成果应用于林业生产实际，对生产中的优良品种进行基因转化具有重要意义[3]。良好的组培再生系统是基因转化的前提，目前已有多个杨树品种的再生研究报道[4-13]。不同杨树品种间组培再生条件存在较大区别，但有关POR再生的研究还未见报道。作者在前人研究的基础上，选择了POR的叶片和茎段2种外植体，对再生环节中的条件进行了研究，旨在建立稳定高效的组培再生系统，为POR杨的快速无性繁殖育苗和基因工程改良工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与培养条件

欧美杨POR种苗由中国林业科学研究院提供。组织培养温度为 (25±1) ℃，光照时间为 16 h·d-1，光照度为 2 000 lx。

1.2 外植体处理

2012年5月—2012年8月，剪取POR 1 a生枝条扦插苗上新生健康嫩枝，流水冲洗2 h后置于超净工作台中，用体积分数为70%的乙醇处理30 s，无菌水冲洗1次，再用1 g·L-1氯化汞溶液消毒3 min，最后用无菌水冲洗5次，获得无菌外植体。茎段剪成长1.5 cm左右，幼嫩叶片横向深达主脉剪3道切口，背面向上接种在芽诱导培养基上，每种处理接种外植体40个。

1.3 丛生芽诱导

以MS为基本培养基，附加不同质量浓度的6-苄氨基嘌呤(6-BA)、噻苯隆(TDZ)和萘乙酸(NAA)(表1)，另加蔗糖30 g·L-1、琼脂5 g·L-1，pH为6.0。每隔15 d在相同培养基上继代培养1次，观察愈伤和丛生芽生长状况，培养30 d后统计各处理丛生芽诱导率。

(1)

表1 不同质量浓度的植物生长调节剂组合对欧美杨POR丛生芽诱导率的影响Table 1 Effect of different hormone concentration on bud induction rate of POR

1.4 丛生芽诱导茎伸长

选择MS为基本培养基，分别添加赤霉素(GA3)、激动素(KT),TDZ,6-BA,NAA,吲哚丁酸(IBA) 等植物生长调节物质(表 2)，另附加蔗糖或果糖 30 g·L-1，琼脂 5g·L-1， pH为6.0。培养 20 d 后观察丛生芽生长状况，统计各处理的茎伸长率和长度大于3 cm芽数量，对比不同处理对茎伸长的影响。

(2)

表2 不同质量浓度的植物生长调节物质组合对POR丛生芽伸长的影响Table 2 Effect of different hormone concentration on enlongation of adventitious buds of POR

1.5 试管苗的生根

以1/2 MS为基本培养基，添加NAA、IBA和吲哚乙酸(IAA)(表3)，另附加蔗糖30 g·L-1、琼脂5g·L-1，pH为6.0. 每处理接种40瓶，20 d后统计各处理的生根率、每苗生根数和平均根长。

表3 不同质量浓度的植物生长调节物质组合对POR不定芽生根的影响Table 3 Effect of different hormone concentration on shoot rooting of POR

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度的植物生长调节剂对外植体丛生芽诱导率的影响

在 TDZ、6-BA 和 NAA同时存在时，茎段和叶片均可直接诱导产生丛生芽，而6-BA和NAA 2者的组合也能诱导出丛生芽，但是诱导率较低 (表1)。在MS+TDZ 0.05 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1的培养基上，茎段外植体接种5 d后，切口处发红膨大，形成少量绿色愈伤组织，15 d 左右愈伤组织上开始出现大量不定芽，丛生芽诱导率达97.3%；每隔15 d在原培养基上继代1次，30 d后不定芽叶片长度为1 cm左右，芽丛生，但没有茎(图1-a)。叶片主叶脉切口处10 d后可见形成的绿色愈伤组织，20 d后才可见丛生芽出现，丛生芽诱导率为88.6 %(图1-b)。

a.茎段外植体; b.叶片外植体。

a. Stem explants; b. Leaf explants.

图1 POR外植体的丛生芽的诱导
Fig.1 Adventitious buds induction on different explants fromPopulus×euramericanaPOR

2.2 不同质量浓度的植物生长调节物质对丛生芽茎伸长的影响

本试验中诱导出的POR丛生芽，在原分化培养基中继代培养，芽不会自行抽茎生长；随着培养时间的延长，丛生芽逐渐衰老黄化而死亡。丛生芽只有经过茎伸长诱导，才能形成有效的再生芽(图2)。在附加 KT和GA3的MS培养基上，丛生芽的茎被高效地诱导伸长生长。在MS+KT 0.5 mg·L-1+GA31 mg·L-1+果糖30 g·L-1的培养基上抽茎生长最好，茎段和叶片从生芽茎伸长率分别达95.5%和90%；诱导第14天，统计高度大于3 cm芽的数量，茎段每丛芽平均有4个抽茎芽，叶片每丛生芽平均有3个抽茎芽(表2)。在MS+KT 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1的培养基上，茎段和叶片茎伸长率分别为60%和45%，同时期抽茎芽数量为2个和1个。MS+6-BA 0.2 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1的培养基上，茎段和叶片茎伸长率分别为28.6%和15%，同时期抽茎芽数量仅有1个。

2.3 不同质量浓度的植物生长调节物质对欧美杨POR试管苗生根的影响

POR对不同的植物生长调节物质的生根反应略有差别(表3)。在1/2MS + NAA 0.05 g.L-1+IBA 0.05 g·L-1培养基中生根最好，试管苗培养7 d后，茎基部长出红色根点，14 d生根率为92.2%，平均为4.5条根，根长平均为1.8 cm，主根较粗，须根丰富(图3-a)，经过生根培养 20 d后，根系丰富，苗体健壮(图3-b)，可以满足移栽的需要。其次是1/2 MS+NAA 0.02 g·L-1+IBA 0.05 g·L-1+IAA 0.05 g·L-1培养基，生根率为90.3%，平均3.7条根，根长平均为1.4 cm。培养基1/2 MS+IBA 0.02 g·L-1+IAA 0.05 g·L-1的生根效果尚可，生根率为89%，平均2.7条根，根长平均 1.2 cm。

a.茎段丛生芽; b.叶片丛生芽。a.Elongation for adventitious buds from stem explants; b. Elongation for adventitious buds from leaf explants.

a.新生根系; b.生根苗。

a. New roots in medium; b. Rooting plantlet.

图3 POR组培苗在最适培养基中的生根
Fig.3 Shoot rooting ofPopulus×euramericanaPOR in the optimum culture media

3 结论与讨论

本研究确定了欧美杨POR茎段、叶片2种外植体再生的关键条件，建立的高效再生系统为其基因工程改良提供了基础。结果表明，不定芽诱导最适培养基为MS+TDZ 0.05 mg·L-1+6-BA 0.05 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，TDZ在芽诱导过程中有显著的促进作用；丛生芽需要茎伸长诱导的环节，最适培养基为MS+KT 0.5 mg·L-1+GA31 mg·L-1+果糖30 g·L-1；抽茎芽可直接转入生根培养，生根培养基最适为1/2 MS+IBA 0.05 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1。

有研究表明,较低质量浓度的TDZ有利于不定芽分化，如在河北杨和新疆杨[10]，以及欧美杨‘2001’[11]再生过程中，均发现TDZ的质量浓度对不定芽分化有重要影响，较低质量浓度的TDZ有利于不定芽分化，较高质量浓度抑制了不定芽的分化。在温度等外界条件相同情况下，TDZ 0.05 mg·L-1,6-BA 0.05 mg·L-1和 NAA 0.05 mg·L-1共同配合，不定芽诱导率最高；缺少TDZ激素的组合，芽诱导效率较低。在POR不定芽诱导过程中，较低质量浓度的TDZ存在也是一个有利条件；此外，6-BA和NAA合适质量浓度的配合也非常关键。

在不同品种杨树的组织培养中，在不定芽形成后，诱导茎伸长并非必须环节。白杨派来源的杨树可以不需要更换培养基，不定芽的茎和叶可进一步伸长[5,14]；而黑杨派来源的杨树往往需要更换培养基，细胞分裂素含量在茎伸长培养基中较不定芽诱导培养基中减少，从而促进芽的茎叶的进一步伸长[6]。POR不定芽需要经过茎伸长诱导，这样得到的有效芽最多。本试验结果表明，KT在诱导丛生芽茎伸长过程中活性优于6-BA，GA3和果糖的配合也非常重要。一般认为GA3对试管苗的增殖和伸长有显著效果，但GA3会抑制芽原基的分化和根原基的分化，因此须在愈伤组织已经分化的状态下，加入GA3促进芽的增殖和伸长[8]。张小苹[15]也发现果糖对桑树不定芽抽茎表现出更好的效果，原因可能是不同器官对不同碳源利用能力差异所导致。

有的杨树品种不定芽长成的小苗生根前太弱，从而需要壮化培养，提高其生根和成活率。本试验中的POR无需壮化便可生根。程贵兰等[7]在中黑防杨组培中，直接将无根苗转移到生根培养基中，14 d左右从无根苗基部长出白色小根，20 d 后95% 的无根苗长出许多1～2 cm较粗壮的根，同时苗也进一步长壮，此结果与POR特性相似。但是，对本课题组曾经研究的‘2001’杨来说，抽茎芽壮化培养对生根非常重要，分化芽经过壮化培养后，叶片增大，茎增粗，生长旺盛，诱导生根容易；如果不经壮化培养，则生根困难，小苗成活率低[11]。不同杨树品种组培生根特性差异显著，这种差异的原因有待进一步研究。

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(责任编辑：梁保松)

Establishment of regeneration system for POR(Populus×euramericana)

ZHOU Zhou1, LI Yongli1, YUAN Chunyan1, AN Shiheng2, YIN Xinming2

(1.College of Forestry, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China；2.College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Stem and leaf developing from tender branches outdoor were cultured as the initiation explants to investigate the micropropagation of POR. The results showed that TDZ had significant promoting effect on adventitious bud induction. Cultured explants on MS + TDZ 0.05 mg·L-1+ 6-BA 0.05 mg·L-1+ NAA 0.05 mg·L-1+Sucrose 30 g·L-1was the best way of inducement and differentiation, with inducement rate 97.3% for Stem and 88.6% for leaf from outdoors. For elongation of the induced buds, the suitable culture medium was MS+KT 0.5 mg·L-1+GA3 1 mg·L-1+Fructose 30g·L-1. More than 3 shoots of about 3 cm in hight were elongated from the induced buds of stem explants after 20 days. Shoots could be rooted after elongation. The optimal subculture medium and root inducement culture medium for shoot were 1/2 MS+NAA 0.05 mg·L-1+IBA 0.05 mg·L-1+AC 3 g·L-1+Sucrose 30 g·L-1, and the rooting rate was 92.2%. The key factors affecting the growth ofPopulus×euramericanaPOR in vitro and the optimal tissue culture conditions for it were ascertained.

POR (Populus×euramericana);invitroculture ; buds elongation; rooting

1000-2340(2015)01-0052-05

2014-09-23

国家自然科学基金项目(U1204324); 河南省科技攻关重点项目(132102110037)

周 洲(1978-), 男, 河南信阳人,副教授,博士, 从事林业生物技术研究。

安世恒(1972-), 男, 河南漯河人,教授。

S 772.3

A