刘昆梅, 刘宏鹏, 郭 乐*

1.宁夏医科大学临床医学院, 临床病原微生物重点实验室, 银川 750004;2.宁夏医科大学，颅脑疾病重点实验室, 银川 750004

幽门螺旋杆菌ATCC 43504感染BALB/c小鼠动物胃炎模型的建立及分析

刘昆梅1,2, 刘宏鹏1*, 郭 乐1,2*

1.宁夏医科大学临床医学院, 临床病原微生物重点实验室, 银川 750004;2.宁夏医科大学，颅脑疾病重点实验室, 银川 750004

利用幽门螺旋杆菌标准菌株建立稳定可靠的幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori,Hp)感染小鼠胃炎模型对Hp疫苗研制、Hp致病机制的研究及抗Hp药物的筛选具有重要意义。通过灌胃国际标准菌株幽门螺旋杆菌Hp ATCC 43504，构建了BALB/c小鼠动物胃炎模型。利用小鼠胃部Hp尿素酶活性检测、Hp的定量培养、PCR检测、组织病理学等多种方法鉴定BALB/c小鼠动物胃炎模型。通过Hp诊断试剂盒检测，造模组小鼠的胃组织能使Hp尿素酶试剂变色，呈现玫瑰红色，而健康小鼠的胃组织不能使Hp尿素酶试剂变色，依旧呈现黄色；通过小鼠胃组织匀浆液培养Hp，造模组小鼠的胃组织匀浆液均可在BHI血平板长出Hp菌落，而对照组小鼠的胃组织匀浆液不能培养出Hp菌落；利用PCR对造模组和对照组BALB/c小鼠的胃组织进行Hp检测，造模组小鼠胃组织可扩增出150 bp的DNA产物，而对照组小鼠胃组织无扩增产物；通过HE染色法观察小鼠胃部病理变化和炎症情况，与健康BALB/c小鼠比较，造模组小鼠胃粘膜和粘膜下层有大量白细胞浸润，胃部炎症明显。利用国际标准菌株Hp ATCC 43504菌株成功构建了BALB/c小鼠胃炎模型，为评价防治Hp感染药物的效果奠定了实验基础。

幽门螺旋杆菌; 胃炎模型；小鼠

自1983 年澳大利亚学者Warren 和Marshall成功地从人胃黏膜样品中分离到幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori, Hp)[1]，针对Hp 的研究一直是近20年来胃肠病学的热点课题之一。Hp是慢性胃炎、胃溃疡的病原菌，且与胃癌密切相关[2]。研制治疗性或预防性疫苗是防治Hp感染的有效措施，但迄今尚无产品上市。建立稳定可靠的动物感染模型是Hp疫苗研制的必备条件，对Hp致病机制的研究和抗Hp药物的筛选也有重要意义。

研究者们在不同动物中筛选Hp合适的宿主，同时也尝试用不同的菌株攻击宿主，发现不同菌株在动物体内的致病过程有所不同，用于药物筛选和疫苗评价时的效果也有差异，从而认识到菌株的选择对于Hp 动物模型的成功构建起关键作用。1988年，Lee等[3]从猫胃里分离到1株与Hp形态相似的细菌, 命名为猫胃螺杆菌(Helicobacterfelis,Hf)。Hf能够自然感染无菌小鼠，引起与Hp感染人后类似的胃部炎症发展过程。Hf 感染小鼠模型主要用于研究螺杆菌属细菌的致病机制。然而，针对Hf 细菌的基础性研究相对较少。其次，在与Hp 的比较中，只有病理进程方面的宏观比较，缺少对二者菌株本身差异方面的认识，使得Hf感染小鼠模型对Hp的代表性和说服力不足。1997年，Lee等[4]报道了筛选得到的一种可在小鼠胃部定植的Hp突变株，命名为Hp SS1(sydney strain)。Hp SS1菌株小鼠感染模型被用于观察抗炎症药物的作用，评价Hp 获得耐药基因的频率等方面的研究。

Hp SS1作为小鼠适应菌株对Hp研究具有重要的推动作用。然而，在研究Hp SS1致病机制中，发现Hp SS1虽然有cag毒力岛及cagA和vacA基因，但其cagA基因的功能不完整。筛选Hp SS1 的初衷是使疫苗的评价有一个公认的标准，但是就进入临床研究的少数Hp疫苗来说，对小鼠有保护性的疫苗却在人体内缺乏保护性，似乎SS1的出现只是推动了Hp可以直接用于小动物模型这一进程。基于此，本研究采用国际标准菌株Hp ATCC 43504建立了BALB/c小鼠感染模型，对感染动物胃粘膜组织的Hp尿素酶活性、Hp的培养、病理性变化等进行了初步研究，以期为Hp致病机制研究、筛选Hp疫苗候选抗原及安全的黏膜佐剂提供实验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及培养基 国际标准菌株Hp 43504购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号为ATCC 43504。培养基为含8%羊血的幽门螺旋杆菌BHI培养基(青岛海博生物技术有限公司)，培养时的气体条件为5%氧气、10%二氧化碳和85%氮气。

1.1.2 动物 BALB/c小鼠12只，无特定病原体级别(specefic pathogen Free；SPF级)，雄性，6～8周龄，购自扬州大学比较医学中心。

1.2 方法

1.2.1 Hp 43504感染BALB/c小鼠动物胃炎模型的建立 结合前人研究[5,6]设计BALB/c小鼠Hp感染模型的建立方法，在感染Hp之前，首选灌胃混合抗生素溶液(氨苄青霉素10 mg/mL、庆大霉素 1.2 mg/mL、阿奇霉素10 mg/mL)；12只BALB/c小鼠，0.3 mL/只，1 次/d，共3 d。灌胃混合抗生素一周后，6只小鼠灌胃0.3 mL新鲜培养的Hp(1×109CFU/mL)；6只小鼠灌胃0.3 mL生理盐水，作为阴性对照。

1.2.2 Hp 43504感染BALB/c小鼠动物胃炎模型的鉴定 ①Hp尿素酶活性的检测。取一条小鼠胃组织，加入500 μL Hp尿素酶试剂(胃幽门螺旋杆菌诊断试剂盒)，混匀，室温孵育4 h，观察Hp尿素酶试剂颜色变化。

② Hp的定量培养。根据参考文献设计实验方法[7,8]如下：称取一定重量的小鼠胃组织，用生理盐水冲去内容物，在0.5 mL生理盐水中制备组织均浆液，吸取20 μL组织均浆液，按照1∶10、1∶100和1∶1 000比例稀释。每个稀释度各取100 μL均匀涂布在BHI血平板上，37℃，微需氧(10% CO2、5% O2、85% N2)培养3～5 d。用Hp诊断试剂盒等方法鉴定Hp菌落。

③PCR检测。Hp 16S rRNA的DNA大小为154 bp，根据Thoreson等[9]的结果设计引物：P1-Hp 16S：5′-TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTAAC-3′，P2-Hp 16S：5′-CATAGGATTTCACACCTGACTGACTATC-3′。PCR反应体系为(50 μL)：模板DNA 5 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP体系浓度为200 μmol/L，MgCl2体系浓度为2.5 mmol/L，引物P1-Hp 16S和P2-Hp 16S的体系浓度为2.5 μmol/L，Taq酶1.25 U。PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min。

④ 组织病理学检测。用石蜡包埋经10% 甲醛固定的小鼠胃组织，切成约6 μm厚的组织切片，通过HE染色法观察胃组织炎症情况。

2 结果与分析

2.1 Hp尿素酶活性鉴定

幽门螺旋杆菌可产生大量Hp尿素酶，尿素酶可以分解尿素产生氨，pH升高，使酚红指示剂变色。小鼠胃部Hp尿素酶活性间接反映了幽门螺旋杆菌在小鼠胃部的感染状况。幽门螺旋杆菌感染BALB/c小鼠40 d后，处死2只小鼠，纵向剪取一条小鼠胃组织，按照胃Hp诊断试剂盒说明书操作，鉴定BALB/c小鼠Hp感染模型是否构建成功。实验结果表明：造模组小鼠的胃组织能使Hp尿素酶试剂变色，呈现玫瑰红色，说明造模小鼠胃部定植有可产生尿素酶的细菌，推测可能为Hp。而健康小鼠的胃组织不能使Hp尿素酶试剂变色，依旧呈现黄色(图1,彩图见图版二)，说明阴性对照组小鼠胃部无产尿素酶的细菌存在，初步判断BALB/c小鼠Hp感染模型构建成功。

图1 通过Hp诊断试剂盒检测小鼠胃部Hp尿素酶活性

2.2 Hp的培养

利用小鼠胃组织匀浆选择性培养Hp，可以反映Hp在小鼠胃部是否定植及其定植密度。由图2(彩图见图版二)可见利用BHI血平板培养造模组小鼠胃组织匀浆，6只造模组小鼠均可培养出较多半透明、呈针尖状的菌落，完全符合Hp的菌落特征；挑取菌落通过革兰氏染色在显微镜下可见紫红色弯曲状杆菌。用牙签挑取BHI平板上针尖状的菌落放入胃幽门螺旋杆菌诊断试剂盒的Hp诊断试剂中(图3,彩图见图版二)，进一步鉴定所培养出的菌落能否产尿素酶，实验表明：BHI血平板上的菌落可使Hp尿素酶试剂变成玫瑰红色，说明所培养的细菌可产生尿素酶，推断其可能为Hp。而本实验利用E.coliDH5α(本实验室保存)作为阴性对照菌，E.coliDH5不能使Hp尿素酶试剂变色，依旧为黄色。

图2 通过造模组小鼠胃组织匀浆培养Hp

图3 通过Hp诊断试剂盒鉴定造模组小鼠胃组织培养出的Hp细菌

2.3 Hp的PCR鉴定

根据幽门螺旋杆菌16S rRNA编码基因设计引物，利用PCR对造模组和对照组BALB/c小鼠的胃组织进行Hp检测。PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳可见单一的DNA片段，大小约为150 bp，与理论值一致(图4)。将基因产物送交金斯瑞生物科技有限公司测序，序列与理论序列完全一致。结合造模组小鼠胃部Hp尿素酶检测和小鼠胃组织匀浆Hp选择性培养的结果，可以断定Hp感染小鼠模型构建成功。

图4 造模组小鼠胃组织的Hp鉴定

2.4 小鼠胃部组织病理学鉴定

幽门螺旋杆菌定植胃部，可导致胃部发生炎症反应，长时间定植可导致胃溃疡乃至胃癌的发生。用肉眼观察造模组小鼠胃部，有2只小鼠胃组织呈现溃疡病变，进一步用甲醛固定和石蜡包埋胃组织，切成 6 μm厚的组织切片，通过HE染色法观察小鼠胃部病理变化和炎症情况。与健康BALB/c小鼠比较，造模组6只小鼠的胃黏膜和黏膜下层均有大量白细胞浸润，胃部炎症明显，说明Hp的定植导致小鼠胃部炎症病变(图5，彩图见图版三)。

图5 造模组(A)和对照组(B)小鼠胃组织病理学分析

3 讨论

幽门螺旋杆菌是慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因素，与胃腺癌和胃淋巴瘤密切相关[10]，世界卫生组织(World Health Organization,WHO)已将其列为一类致癌物，Hp 感染动物模型的研究具有重要的临床意义。Hp的自然宿主是人[9]和非人灵长类，宿主谱狭窄，最初人们在传统小型啮齿类实验动物中人工感染Hp均未获得成功。Hp动物模型的缺乏一度成为疫苗研究的限制因素 。目前已建立的Hp感染动物模型主要有无菌乳猪、屏障饲养小猪、普通饲养小猪、小猎犬，啮齿类动物如无菌或SPF 级的豚鼠、BALB/c 小鼠、裸鼠、沙鼠和ICR小鼠等[12]。

Hp动物模型的建立主要与宿主的特异性有关, 对Hp相当敏感的动物有猪、犬、沙土鼠和豚鼠等。另外，Hp菌株的选择也十分重要。1990 年Lee等从猫胃中分离出与人Hp相似的猫螺旋杆菌(Helicobacterfelis,Hf)，并将其感染无菌小鼠获得成功[13]。但是Hf和Hp之间还是存在着较多本质性的区别。早期有报道利用Hf 感染小鼠模型筛选Hp疫苗，但小鼠对Hp的低易感性与Hf 能自然感染小鼠的差别排除了被应用的可能，且有研究证明以Hp 的外膜蛋白成分作免疫原并不能使小鼠获得对Hf的免疫保护能力，说明Hf和Hp感染小鼠过程中的免疫反应存在差异。其次，Hp能够粘附于胃上皮细胞，而Hf不能；Hp有与致病性紧密相关的CagA和VacA蛋白，而Hf没有CagA和VacA蛋白。1997年，Lee等[4]利用一种Hp的突变株(Hp SS1)建立了BALB/c和C57BL/6小鼠感染模型。Hp SS1感染率高、结果稳定、病理检查有类似人胃炎的病变，成为构建Hp感染动物模型的理想菌株。但是，在研究Hp SS1 致病机制的过程中, 发现Hp SS1的cagA基因的功能不完整。筛选Hp SS1的初衷是使Hp疫苗的评价有一个公认的标准，但是就临床使用过的少数疫苗来说，对小鼠有保护性的Hp疫苗在人体却缺乏保护性，似乎Hp SS1的出现只是推动了Hp可以直接用于小动物模型这一进程。因此，利用非突变的国家标准Hp菌株建立动物模型具有重要意义。

为了提高国际标准菌株Hp ATCC 43504感染BALB/c小鼠的成功几率，本研究首先灌胃混合抗生素，清除BALB/c小鼠胃部细菌，破坏小鼠胃肠道细菌微生态平衡，增加Hp在小鼠胃部的定植几率。有研究报道利用50%酒精也可破坏胃环境，便于Hp在小鼠胃部的定植，但是酒精并不能彻底清除小鼠胃部已定植的细菌[14]。若仅用小鼠胃部匀浆Hp培养的方法来检测是否感染Hp，检出率往往较低。Hp是一种微需氧细菌，对培养基及培养条件有较高的要求。当周围环境不利于细菌的生长时，如小鼠胃部感染其他细菌、培养期间与空气接触、温度不恒定、培养基pH升高等，都会导致Hp产生变异体或不生长。其次，培养期间湿度掌握不好，很容易感染霉菌，给Hp菌落的判断带来困难。本研究利用国际标准菌株成功构建Hp感染小鼠模型，为Hp治疗药物筛选、预防性或治疗性Hp疫苗的研究及Hp致病机理探讨奠定了实验基础。

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Establishment and Analysis of Gastritic Model ofHelicobacterpyloriATCC 43504 Infection in BALB/c Mice

LIU Kun-mei1,2, LIU Hong-peng1*, GUO Le1,2*

1.KeyLaboratoryofClinicalPathogenicMicroorganisms,ClinicalMedicalCollege,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China;2.NingxiaKeyLaboratoryofCerebrocranialDiseases,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan210009,China

The establishment of stable and reliable mouse gastritic model usingHelicobacterpylori(Hp) standard strains has important significance in the research of Hp vaccine development, Hp pathogenesis and screening of anti-Hp drugs. In this study, the BALB/c mouse gastritic models were constructed by international standard strain Hp ATCC 43504. Then the BALB/c mouse gastritic models were analyzed by Hp urease activity detection, Hp quantitative culture, PCR detection and histopathological staining methods. The mice gastric tissues from BALB/c mouse gastritic models could make Hp urease reagent appear rose red by analysis of Hp diagnostic kit. But mice gastric tissues from control group could not enable Hp change color and still appear yellow. Hp could grow up at BHI blood plate by Hp quantitative culture using gastric homogenate from BALB/c mouse gastritic models, but Hp could not emerge at BHI blood plate by Hp quantitative culture using gastric homogenate from control group. 150 bp DNA products could be amplified from gastric tissue of BALB/c mice in the model group by PCR, while the control group was no amplification products. HE staining method was used to observe the pathological changes and inflammation in mice. Compared with BALB/c mice from the control group, there was a large number of white blood cell infiltration in the gastric mucosa from the model group. BALB/c mouse gastritic models were constructed using Hp ATCC 43504, which could be used to evaluate the effect of the drug on the prevention and treatment of Hp infection.

Helicobacterpylori; gastritic model; mice

2015-08-09; 接受日期：2015-08-26

宁夏自然科学基金项目(NZ14089)资助。

刘昆梅，讲师，研究方向生物技术药学。E-mail：lkm198507@126.com。*通信作者：刘宏鹏，讲师，研究方向为基因工程疫苗。E-mail:yangliang1027@163.com。郭乐，副教授，博士，研究方向为基因工程疫苗。E-mail:gouletian1982@163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.06.08