彭建明，苏兰娣，罗 雪，叶记林，于有江

（扬州职业大学医学院，江苏扬州225009）

眼镜蛇长链神经毒素镇痛效应及可能机制

彭建明，苏兰娣，罗 雪，叶记林，于有江

（扬州职业大学医学院，江苏扬州225009）

目的探究眼镜蛇长链神经毒素（CBT）的镇痛作用及可能机制。方法采用在体细胞外记录方法记录慢性炎症痛模型大鼠脊髓背角神经元的痛诱发放电，分别对六组实验大鼠注射生理盐水（5 μL）、CBT（20、40、80 ng/kg）、阿托品（2 mg/kg）、阿托品（2 mg/kg）+CBT（40 ng/kg），观察不同含量CBT对脊髓背角神经元痛诱发放电的影响，同时观察胆碱能受体拮抗剂阿托品能否翻转其镇痛效应。结果不同含量CBT均可以显著抑制慢性炎症痛大鼠脊髓背角神经元的痛诱发放电，各含量CBT组放电频率与生理盐水组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），且该效应可被阿托品所阻断，阿托品+CBT组在20、30、40、50、60 min放电频率与CBT（40 ng/kg）组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论CBT具有显著的镇痛效应，该效应有一定的剂量依赖性，胆碱能受体系统参与了其镇痛过程。

眼镜蛇毒液类； 眼镜蛇属； 神经毒素类； 镇痛

疼痛是一种伴随组织损伤的复合感觉，常与心理活动、运动反射、情绪等交织在一起，往往具有个体差异、令人不悦的感觉和情绪上的感受。疼痛的生物学意义具有双重特点：一方面是机体不可或缺的一种特殊保护功能，出现痛觉的防御反应，进而警告机体及时采取措施来避免进一步的伤害，减轻病痛；另一方面，其又可形成病理性的慢性疼痛综合征，许多剧烈的持续性疼痛对人体造成严重的折磨，给人类造成的苦难和伤害也是不可估量的。目前虽然有手术、针刺、药物等减轻痛觉感受的方法，但均有其局限性，因此，寻求一种有效的镇痛方法一直是患者和临床工作者的述求。

祖国医学很早就有利用蛇毒为人类服务的记载。蛇毒是一种由蛇毒腺分泌的复杂混合物，按其作用部位与方式主要分为2种基本类型：一种是作用于神经-肌肉接头的接头前膜，进而抑制突触前神经元乙酰胆碱的释放，故称为突触前神经毒素，也称为β-神经毒素；另一种是作用于神经-肌肉接头处的接头后膜，与接头后膜上的胆碱能受体结合后抑制乙酰胆碱的作用，进而可引起肌肉松弛，称为突触后神经毒素，也称为α-神经毒素。这2种蛇毒神经毒素都阻断神经-肌肉接头处的兴奋传递，引起肌肉麻痹、松弛。有研究发现，眼镜蛇蛇毒神经毒素除了有抗肿瘤、抗炎、治疗心脑血管和神经系统疾病的作用外，还具有镇痛作用[1-4]。有研究结果显示，在小鼠的扭体法和热板法的行为测试中，分离出来的眼镜蛇长链神经毒素（cobratoxin，CBT）可产生显著的镇痛效应，并能够明显抑制慢性炎症大鼠的痛反应[5-6]。因此，本实验主要采用在体细胞外记录的方法观察CBT对慢性炎症痛模型大鼠脊髓背角神经元单位放电的影响，同时分析其镇痛效应与胆碱能受体的关系，以探讨CBT镇痛效应的可能机制，为临床开发蛇毒作为镇痛药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 无特定病原体SPF级雄性SD大鼠48只，体质量220～320 g，由扬州大学动物实验中心提供。12 h明暗交替光照，给予充足的水源和饲料。根据实验中注射试剂不同，将建立模型后选择出来的实验大鼠随机分为六组：生理盐水组、不同含量CBT组（20、40、80 ng/kg）、阿托品组、阿托品+CBT组，每组8只。实验所用阿托品购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 建立慢性炎症痛模型 在每只健康大鼠的右侧后肢足底皮下注射完全弗氏佐剂（complete Freund′s adjuvant，CFA）0.15 mL，注射后局部炎性反应明显。选取注射CFA 7 d后，皮温升高，右足红肿，右侧后肢踝关节肿胀，经行为学检测痛觉过敏的大鼠作为实验对象。生理盐水组：在每只健康大鼠右侧后肢相同部位注射同样容积的生理盐水作为对照，1周后未见红肿、皮温升高及痛觉过敏等现象。

1.2.2 动物准备 实验用健康成年雄性SD大鼠，体质量220～320 g，4%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔注射麻醉，气管插管，固定动物于立体定位仪上。大鼠脊柱固定，于腰膨大T13至L1处行椎板切开术，切开脊髓的硬脊膜与蛛网膜，使暴露的脊髓与周围组织形成一个小池。游离同侧后肢坐骨神经约1.5 cm，并将刺激电极置于游离出坐骨神经上。在大鼠坐骨神经暴露处定时滴加液体石蜡，以防坐骨神经干燥。术后用三碘季胺酚（40 mg/kg）制动，用温控仪将动物肛温维持在37.5℃左右，在维持麻醉下进行实验，分别对六组实验大鼠注射生理盐水（5 μL）、CBT（20、40、80 ng/kg）、阿托品（2 mg/kg）、阿托品（2 mg/kg）+CBT（40 ng/kg）。随时观察大鼠肢端皮肤色泽，同时连续监测大鼠心电图，如若异常立即终止实验。

1.2.3 记录实验数据 稳定记录到脊髓背角广动力范围（WDR）神经元放电5 min后开始实验，电刺激坐骨神经作为伤害性刺激，以给予电刺激后WDR神经元5 s的放电频率（spikes/s）为指标，分别记录给药前后的放电频率，以给药前伤害性刺激放电频率为100%，给药后的各时间点放电频率折算成相对值。

1.3 统计学处理 应用Powerlab软件（Chart V5.3）采集放电图形并测量痛诱发放电频率。应用SPSS10.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同含量CBT对炎症模型大鼠脊髓背角WDR神经元痛诱发放电的影响 在大鼠脊髓表面滴注不同含量CBT对佐剂性炎症大鼠脊髓背角WDR神经元的痛诱发放电均有显著的抑制效应。CBT组（20 ng/kg）在给药后30 min开始产生明显抑制作用，而40、80 ng/kg CBT组在给药后20 min开始产生显著抑制作用，各组放电频率与生理盐水组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。而且随着CBT含量增加，对脊髓背角WDR神经元痛诱发放电抑制率增高，且不同含量CBT组对脊髓背角WDR神经元痛诱发放电的抑制率随时间持续性增高。见图1。

2.2 阿托品对CBT在炎症模型大鼠脊髓背角WDR神经元痛诱发放电的影响 阿托品组大鼠预先腹腔注射阿托品2 mg/kg 2 h后，其对炎症大鼠脊髓背角WDR神经元的痛诱发放电频率与生理盐水组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。阿托品+CBT组在给药20、30、40、50、60 min后均显著降低了对脊髓背角WDR神经元痛诱发放电的抑制，放电频率与CBT（40 ng/kg）组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图1 不同含量CBT对炎症模型大鼠脊髓背角WDR神经元痛诱发放电的影响

图2 阿托品对CBT在炎症模型大鼠脊髓背角WDR神经元痛诱发放电的影响

3 讨 论

痛觉信号在上行传导的过程中，在中枢神经系统的每一个水平，都具有一定的整合功能。以往对眼镜蛇神经毒素在慢性炎症疼痛的镇痛作用鲜有报道。Liu等[7]用CFA建造模型（造模）引起大鼠持续炎症疼痛并出现痛觉过敏，在造模成功后第11天开始腹腔注射CBT能显著抑制佐剂性炎症大鼠的机械痛敏和热痛敏，说明CBT具有抗炎、减轻疼痛作用。近年来，随着对慢性炎症疼痛机制探究的深入，发现脊髓背角神经元与慢性炎症疼痛的发生和发展存在着紧密关系。大量的实验研究及临床案例均已证实眼镜蛇神经毒素具有镇痛作用[8-10]，但对于具体镇痛机制的研究报道较少。因此，本实验是观察不同浓度CBT对慢性炎症痛模型大鼠脊髓背角的痛诱发放电的影响，发现不同浓度CBT对慢性炎症痛模型大鼠脊髓背角的痛诱发放电均具有显著抑制效应，且具有一定的剂量依赖性，证实了其具有显著镇痛效果。

在痛觉信息传递及调制的生理过程中，神经递质阿片肽、5-羟色胺、乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）、一氧化氮、腺苷三磷酸、腺苷、降钙素基因相关肽等均参与了痛觉的调制。其中，ACh是最早被确定的神经递质之一，其广泛分布于大脑皮层、脑干和脊髓等部位。有文献证明，拟胆碱类药参与了针刺镇痛过程，且镇痛部位在中枢神经而不是在外周神经[11]。针刺镇痛时中枢ACh合成释放和更新率都升高，胆碱酯酶的活性提高；应用药物使ACh在一定部位的积聚可使镇痛效应加强，反之减弱。目前关注的蛇毒神经毒素的镇痛部位主要位于中枢。脑室、中脑导水管周围灰质微量注射蛇毒神经毒素也可产生显著的镇痛效应。蛇毒的镇痛作用能在热板法的实验（热板法的行为反应是一个脊髓以上高级中枢整合的反应）中很好地反映出来，但有研究显示，在大鼠的甩尾实验中，蛇毒神经毒素无显著镇痛效应，说明蛇毒的镇痛部位仅限于脊髓以上的高位水平，但也不能完全排除外周镇痛的可能性[12]。

蛇毒神经毒素镇痛作用时间长、效价高，且连续用药后不耐受，明显优于阿片肽及其衍生物，属于麻醉性镇痛药，CBT镇痛作用是否与阿片肽受体有关尚有待于进一步研究。有研究显示，蛇毒神经毒素的镇痛作用与中枢M胆碱能系统兴奋有关[13-14]。为进一步揭示CBT对慢性炎症大鼠镇痛的可能机制，本实验使用了胆碱能受体拮抗剂阿托品，发现阿托品可以翻转CBT对慢性炎症大鼠的脊髓背角神经元痛诱发放电的抑制作用，提示阿托品可以显著翻转CBT的镇痛作用，从而表明CBT的镇痛作用可能与胆碱能受体系统有关，至于其确切机制及其与阿片肽的关系尚有待于进一步研究证实。

[1]殷方臣，郑颖，邱薇，等.蛇毒神经毒素研究进展[J].动物医学进展，2008，29（8）：67-70.

[2]Chen ZX，Zhang HL，Gu ZL，et al.A long-form alpha-neurotoxin from cobra venom produces potent opioid-independent analgesia[J].Acta Pharmacol Sin，2006，27（4）：402-408.

[3]闵志雪，黄璐，孙瑶，等.皖南地区眼镜蛇毒活性组分镇痛效应的初步研究[J].中国病理生理杂志，2013，29（1）：150-154.

[4]Zhang HL，Han R，Chen ZX，et al.Analgesic effects of receptin，a chemically modified cobratoxin from Thailand cobra venom[J].Neurosci Bull，2006，22（5）：267-273.

[5]Zhang HL，Han R，Gu ZL，et al.A short-chain alpha-neurotoxin from Naja naja atra produces potent cholinergic-dependent analgesia[J].Neurosci Bull，2006，22（2）：103-109.

[6]Ruan Y，Yao L，Zhang B，et al.Anti-inflammatory effects of Neurotoxin-Nna，a peptide separated from the venom of Naja naja atra[J].BMC Complement Altern Med，2013，13：86.

[7]Liu YL，Lin HM，Zou R，et al.Suppression of complete Freund′s adjuvantinduced adjuvant arthritis by cobratoxin[J].Acta Pharmacol Sin，2009，30（2）：219-227.

[8]Nogueira-Neto Fde S，Amorim RL，Brigatte P，et al.The analgesic effect of crotoxin on neuropathic pain is mediated by central muscarinic receptors and 5-lipoxygenase-derived mediators[J].Pharmacol Biochem Behav，2008，91（2）：252-260.

[9]王金保，王姝媛，王琪，等.眼镜蛇毒因子对神经病理性疼痛大鼠脊髓背角神经元的保护效应[J].临床麻醉学杂志，2010，26（4）：333-335.

[10]Cheng BC，Zhou XP，Zhu Q，et al.Cobratoxin inhibits pain-evoked discharge of neurons in thalamic parafascicular nucleus in rats：involvement ofcholinergic and serotonergic systems[J].Toxicon，2009，54（3）：224-232.

[11]关新民，王才源，余湢，等.中枢乙酰胆碱与针刺镇痛关系的研究[J].针刺研究，1991，16（2）：129-137.

[12]Picolo G，Giorgi R，Cury Y，et al.delta-opioid receptors and nitric oxide mediate the analgesic effect of Crotalus durissus terrificus snake venom[J]. Eur J Pharmacol，2000，391（1/2）：55-62.

[13]王海华，张根葆，闵志雪，等.皖南地区眼镜蛇毒镇痛组分对大鼠炎性痛作用机制探讨[J].中国临床药理学与治疗学，2013，18（10）：1093-1099.

[14]梁映霞，张志宇，赵树进.鞘内注射眼镜蛇毒活性成分对大鼠神经病理性疼痛的镇痛作用[J].广东医学，2012，33（7）：909-911.

Analgesic effect of cobratoxin and its possible mechanism

Peng Jianming，Su Landi，Luo Xue，Ye Jilin，Yu Youjiang
（Medical College of Yangzhou Polytechnic College，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）

ObjectiveTo investigate the analgesic effect of cobratoxin（CBT）and its possible mechanisms.MethodsThe pain-evoked discharge from the spinal dorsal horn neurons in rats with chronic pain was recorded by the somatic extracellular record method.The 6 experimental rat groups were injected by the normal saline（5 μL），CBT（20，40，80 ng/kg），atropine（2 mg/kg）and atropine（2 mg/kg）+CBT（40 ng/kg）respectively.The influence of different concentrations of CBT on the pain-evoked discharge from the spinal dorsal horn neurons was observed.At the same time，whether cholinergic receptor antagonist atropine overturning its analgesic effect was observed too.ResultsThe different concentrations of CBT could obviously inhibit the pain-evoked discharge from the spinal dorsal horn neuron in rats with chronic pain，the discharge frequency had statistically significant difference betweenthe differentconcentrationandthe normalsaline group（P＜0.05），moreover the effect could be blocked by atropine，the difference of the discharge frequency at 20，30，40，50，60 min had statistical difference between the atropine+CBT group and the CBT40ng/kggroup（P＜0.05）.ConclusionCBT possesses a significantanalgesic effect，this effecthas certain dose dependence and the cholinergic receptor system participates in this analgesic process.

Cobra venoms； Cobra； Neurotoxins； Analgesia

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.19.003

A

1009-5519（2015）19-2896-03

2015-05-28）

关于医学论文中的志谢

本刊编辑部

江苏省卫生厅卫生职业技术教育基金资助项目（NJ201112）；扬州环境资源学院校级课题（N201129）。

彭建明（1984-），男，江苏射阳人，硕士研究生，讲师，主要从事医学神经生物学、痛觉调制的研究；E-mail：shmily_peng@163.com。

于有江（E-mail：51229768@qq.com）。

在文后志谢是表示感谢并记录在案的意思。对给予实质性帮助而又不能列为作者的单位或个人应在文后给予志谢。但必须征得被志谢人的书面同意。志谢应避免以下倾向：（1）确实得到某些单位或个人的帮助，甚至用了他人的方法、思路、资料，但为了抢先发表，而不公开志谢和说明；（2）出于某种考虑，将应被志谢人放在作者的位置上，混淆了作者和被志谢者的权利和义务；（3）以名人、知名专家包装自己的论文，抬高论文的身份，将未曾参与工作的，也未阅读过该论文的知名专家写在志谢中。被志谢者包括：（1）对研究提供资助的单位和个人、合作单位；（2）协助完成研究工作和提供便利条件的组织和个人；（3）协助诊断和提出重要建议的人；（4）给予转载和引用权的资料、图片、文献、研究思想和设想的所有者；（5）作出贡献又不能成为作者的人，如提供技术帮助和给予财力、物力支持的人，此时应阐明其支援的性质；（6）其他需志谢者。