何贵成，严思佳，丁 恩，艾小红

（南华大学附属第一医院肿瘤内科，湖南衡阳421001）

8-硝基白杨素诱导人肝癌HepG2细胞分化研究

何贵成，严思佳，丁 恩，艾小红

（南华大学附属第一医院肿瘤内科，湖南衡阳421001）

目的探讨传统中药蜂胶的有效成分白杨素的人工半合成类似物8-溴-7-甲氧基白杨素，即8-硝基白杨素（BrMC）是否具有诱导人肝癌细胞分化作用。方法体外培养人肝癌HepG2细胞，分别加入1.0μg/mL BrMC和1.0 μg/mL全反式维甲酸（ATRA），同时设溶媒对照组和空白对照组。瑞氏-姬姆萨染色法检测BrMC诱导HepG2细胞形态与核质比的变化；酶促反应试剂盒检测BrMC和ATRA诱导HepG2细胞中碱性磷酸酶（ALP）和γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）的活性；放射免疫法检测甲胎蛋白（AFP）的质量分数；Diamondstone分光光度法（速率法）检测酪氨酸转氨酶（TAT）的活性。结果1.0 μg/mL BrMC处理的细胞核质比远低于溶媒对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。1.0 μg/mL BrMC、ATRA组处理24、48、96 h的HepG2细胞液中AFP质量分数，γ-GT、ALP、TAT活性分别与溶媒对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论BrMC能降低HepG2细胞核质比、减少HepG2细胞的AFP分泌、有效地活化HepG2细胞TAT、ALP；且BrMC和ATRA均能抑制HepG2细胞γ-GT活性。BrMC通过以上作用诱导人肝癌细胞分化。

植物提取物； 肝肿瘤/病理学； 肿瘤细胞，培养的； 8-硝基白杨素； HepG2细胞； 分化； 诱导

肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一。肝癌在我国发病率高，占全球50%以上[1-2]。而目前提高肝癌疗效大多倾向于依赖药物治疗，现有的常规化疗药物选择性低、毒性作用严重，且单药有效率很少超过25%[3]。因此，寻找选择性高的抗肝癌药物，仍是肝癌防治研究的重要方向。近年来，随着癌细胞再分化概念的提出，恶性肿瘤的诱导分化治疗已成为肿瘤生物学和肿瘤治疗学的研究热点和前沿领域。白杨素（5，7-二羟黄酮，chrysin）是一种具有广泛药理活性的天然黄酮类化合物，在蜂胶和蜂蜜中含量较高，并在多种恶性肿瘤中具有抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡作用，例如乳腺癌[4-5]。但基于白杨素的口服生物利用度差，其口服制剂被用于临床肿瘤防治的可能性不大[6]。8-硝基白杨素（8-溴-7-甲氧基白杨素，BrMC）作为白杨素的一种新衍生物，具有良好的抗肿瘤作用。目前，许多学者发现，BrMC对肿瘤干细胞也有重要作用，BrMC能通过下调看家基因（βcatenin）抑制肝癌干细胞性能[7]。而目前有关BrMC诱导人肝癌HepG2细胞分化作用鲜有报道。

本研究拟体外培养人肝癌HepG2细胞，通过瑞氏-姬姆萨染色法观察BrMC是否具有诱导HepG2细胞分化作用，试图寻求具有高效的、毒性作用小的治疗人肝癌的候选药物。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌HepG2细胞购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。BrMC由南华大学药学系郑兴教授惠赠，性状：黄色晶体；纯度大于98%。全反式维甲酸（ATRA）购自Sigma公司。二甲基亚砜（DMSO）购自美国Amresco公司；吉姆萨染液购自Sigma公司；胰酶消化液购自碧云天生物试剂有限公司；其余为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 人肝癌HepG2细胞核质比的测量 将清洁灭菌的22 mm×22 mm载玻片置6孔细胞培养板中，取对数生长期HepG2细胞，每孔2×104个细胞接种于6孔细胞培养板。培养24 h，待细胞贴壁，吸弃培养基，加入含1.0 μg/mL BrMC和1.0 μg/mL ATRA的培养基，培养48h。取出载玻片，进行瑞氏-姬姆萨染色，光镜下观察细胞形态变化，测量细胞核质比。

1.2.2 细胞特异性酶和蛋白的测定 取对数期生长的细胞每毫升2×104个接种于50 mL培养瓶，每瓶1 mL，分别加入1.0μg/mLBrMC和1.0μg/mLATRA，同时设溶媒对照组[0.1%乙醇（EtOH）]、空白对照组，每组3个平行瓶，培养96 h后分别收集不同时期（0、24、48、96 h）细胞和培养液。采用超声破碎法裂解细胞，放射免疫法测定细胞培养液的甲胎蛋白（AFP）质量分数；酶促反应试剂盒检测γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）和碱性磷酸酶（ALP）的活性；Diamondstone分光光度法（速率法）测定酪氨酸转氨酶（TAT）的活性。

1.3 统计学处理 应用SPSS15.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，两两比较采用Students′t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BrMC对人肝癌HepG2细胞核质比的影响 1.0μg/mL BrMC处理的细胞核质比为（0.16±0.06），比同质量浓度的ATRA[（0.15±0.03）]略高，远低于溶媒对照组[（0.34± 0.06）]，差异有统计学意义（P＜0.01）。说明BrMC具有很强地诱导HepG2细胞分化的能力。见图1。

图1 BrMC对人肝癌HepG2细胞核质比的影响

2.2 BrMC对人肝癌HepG2细胞AFP质量分数的影响

1.0 μg/mL BrMC处理0、24、48、96 h后HepG2细胞液中AFP质量分数分别为（302±12）、（224±8）、（131±5）、（83±2）μg/g，1.0 μg/mL ATRA处理0、24、48、96 h后HepG2细胞液中AFP质量分数分别为（318±10）、（214±9）、（150± 06）、（112±2）μg/g；溶媒对照组处理 0、24、48、96 h后HepG2细胞液中AFP质量分数分别为（300±10）、（292±9）、（320±4）、（308±10）μg/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA组处理24、48、96 h后HepG2细胞液中AFP质量分数分别与溶媒对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。说明BrMC能有效减少HepG2细胞的AFP分泌。见图2。

图2 BrMC对人肝癌HepG2细胞AFP含量的影响

2.3 BrMC对人肝癌HepG2细胞γ-GT活性的影响1.0 μg/mL BrMC处理0、24、48、96 h后HepG2细胞液中γ-GT的活性分别为（68±5）、（46±3）、（33±3）、（23±1）U/g；1.0 μg/mL ATRA处理0、24、48、96 h后HepG2细胞液中γ-GT的活性分别为（68±4）、（29±3）、（22±1）、（17±1）U/g；溶媒对照组处理0、24、48、96 h后HepG2细胞液中 γ-GT的活性分别为（68±2）、（64±2）、（67±1）、（63±1）U/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA组处理 24、48、96 h后 HepG2细胞液中γ-GT活性分别与溶媒对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。说明BrMC和ATRA均能抑制HepG2细胞GGT活性。见图3。

图3 BrMC对人肝癌HepG2细胞γ-GT活性的影响

2.4 BrMC对人肝癌HepG2细胞ALP活性的影响1.0 μg/mL BrMC处理0、24、48、96 h后HepG2细胞液中ALP的活性分别为（349±12）、（576±15）、（870±31）、（1 185±46）U/g；1.0 μg/mL ATRA处理 0、24、48、96h后HepG2细胞液中ALP的活性分别为（349±10）、（680± 20）、（870±31）、（1 288±58）U/g；溶媒对照组处理0、24、48、96 h后HepG2细胞液中ALP的活性分别为（349±12）、（347±12）、（350±31）、（352±46）U/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA组处理24、48、96 h后HepG2细胞液中ALP活性分别与溶媒对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。说明BrMC和ATRA均能提高HepG2细胞ALP活性。见图4。

图4 BrMC对人肝癌HepG2细胞ALP活性的影响

2.5 BrMC对人肝癌HepG2细胞TAT活性的影响1.0 μg/mL BrMC处理0、24、48、96 h后HepG2细胞液中TAT的活性分别为（15.0±1.0）、（25.0±1.6）、（35.0±2.1）、（48.0±2.4）U/g；1.0 μg/mL ATRA处理 0、24、48、96 h后HepG2细胞液中TAT的活性分别为（17.0±0.8）、（24.5± 1.4）、（34.0±2.0）、（45.0±2.2）U/g；溶媒对照组处理0、24、48、96 h后HepG2细胞液中TAT的活性分别为（15.0± 0.8）、（17.0±0.8）、（15.0±0.8）、（17.6±1.0）U/g。1.0 μg/mL BrMC、ATRA组处理24、48、96 h后HepG2细胞液中TAT活性分别与溶媒对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.01）。说明BrMC能够有效地活化HepG2细胞TAT。见图5。

图5 BrMC对人肝癌HepG2细胞TAT活性的影响

3 讨 论

一般认为，癌细胞是细胞在早期分化阶段被致癌物转化为低分化、高增殖的细胞；而在细胞接近于分化完成时，被致癌物转化为高度分化的、低增殖的细胞。不管癌细胞是来自成熟细胞的反分化或来自未成熟细胞的异常分化，还是阻抑正常细胞的分化，都可以看作是一种细胞分化的疾病，目前已被证实有许多生成因子或化学物质在体内或体外可促进癌细胞分化而降低肿瘤恶性程度的事实，为发展抗癌治疗开辟了一条新途径──分化诱导治疗[8]。

肿瘤细胞分化诱导治疗是指在一些化学制剂的作用下，不杀伤肿瘤细胞，而诱导肿瘤细胞分化为正常或接近正常细胞表型，以促进体内肿瘤细胞分化来治疗癌症。随着ATRA治疗人急性早幼粒细胞白血病获得显著疗效后，分化诱导疗法已成为国际肿瘤研究的新热点。Reddi等[9]研究结果显示，PAX8/过氧化物酶体增殖因子活化受体γ（PPARγ）融合蛋白的表达可显著促进甲状腺癌细胞中PAX8、甲状腺过氧化物酶（TPO）、钠碘同向转运（NIS）和甲状腺球蛋白的过表达，从而诱导甲状腺癌细胞的再分化，抑制甲状腺癌细胞的生长；Haghpanah等[10]的体外研究表明，丙戊酸可诱导未分化甲状腺癌细胞再分化，也能降低甲状腺癌的肿瘤干细胞特性。因此，寻找高效、低毒分化诱导剂已成为药物化疗肿瘤的重点方向。

最新数据显示，BrMC能通过不同的作用机制发挥抗肿瘤作用。例如BrMC能显著抑制HER-2/neu-乳腺癌的增殖活性[11]；也可通过与噻唑烷酮类化合物不同结合的方式，激活PPARr抑制环氧醇2（COX-2）的活性[12]。

近30年来，随着癌细胞的诱导分化和分化治疗的发展，但有关肝癌细胞的分化研究报道尚不多。黄炜等[13]研究证实，丁酸钠（SB）处理肝癌细胞后，细胞核质比明显减小，鸟氨酸氨基甲酰转移酶（OCT）、TAT和ALP活性明显升高，AFP分泌量和γ-GT活力明显下降，表明SB可诱导肝癌细胞再分化。ATRA是公认的细胞分化诱导剂，在治疗人急性早幼粒细胞白血病方面已获得显著疗效。最近研究发现，ATRA可降低SMMC-7721细胞的AFP分泌量和γ-GT活性，升高ALP和加强TAT活性，增加清蛋白的分泌量[14-15]。AFP和γ-GT是2个公认的人类肝癌的标志物，而ALP和TAT只有在成熟分化的肝细胞中表达，是肝细胞成熟分化的标志。这些研究结果在体外细胞培养水平上证明了ATRA对SMMC-7721细胞的诸多恶性表型具有逆转作用。因此，本研究拟体外培养人肝癌HepG2细胞作为实验对象，BrMC作为处理因子，通过与细胞分化诱导剂（ATRA）对比，观察HepG2细胞形态与核质比的变化、检测细胞中ALP和γ-GT活性的变化及AFP质量分数、TAT活性，以证实BrMC是否对人肝癌HepG2细胞存在诱导再分化作用。

众所周知，肝癌细胞分化不良在形态学上主要表现为细胞明显增大，染色深，核大，核圆呈多型，核质比失常[16-17]。本研究在体外培养的HepG2细胞中分别加入1.0 μg/mL BrMC和1.0 μg/mL ATRA后，通过瑞氏-姬姆萨染色，光镜显微镜下测量发现细胞核质比明显降低。提示BrMC具有诱导人肝癌细胞HepG2分化的效应。为探讨肝癌细胞分化的指标，结合文献报道，选用了4种可以反映肝细胞分化的酶和蛋白作为观察对象。γ-GT和TAT均是肝癌的标志酶，γ-GT主要分布于肝、胰等组织，参与γ-谷氨酰循环，与肝癌的分化程度呈负相关，后者则呈正相关[18]。AFP是胎肝、再生肝及肝癌细胞所产生的一种癌胚蛋白，其量的多少反映肝细胞去分化程度的高低，是公认的肝癌肿瘤标志[19]。ALP是成熟肝细胞分泌的蛋白，可作为肝细胞分化的标记蛋白[20]。本研究结果提示，BrMC能诱导HepG2细胞分化，逆转其恶性表型。BrMC具有诱导人肝癌HepG2细胞分化的活性。

因此，本研究结果证实，传统中药蜂胶的有效成分白杨素的类似物BrMC能降低HepG2细胞核质比、减少HepG2细胞的AFP分泌及有效地活化HepG2细胞TAT、ALP；且BrMC和ATRA均能抑制HepG2细胞γ-GT活性。BrMC通过以上作用诱导人肝癌细胞分化。但值得注意的是，分化的观察指标应是一个综合性指标，单独观察其中任一项指标，均无法证明肿瘤细胞的分化，而应综合观察细胞的形态、功能及生物学行为3个方面的指标。随着肿瘤干细胞学说的提出，作者认为，肿瘤的本质是一种干细胞疾病，于是设想BrMC可能首先是通过诱导肝癌干细胞分化，进而抑制肝癌干细胞自我更新，但尚有待于另外申报研究项目进行探索。

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Study on BrMC induced differentiation of human hepatocarcinoma HepG2 cells

He Guicheng，Yan Sijia，Ding En，Ai Xiaohong
（Department of Oncology，First Affiliated Hospital，University of South China，Hengyang，Hunan 421001，China）

ObjectiveTo evaluate whether the artificial semisynthetic analogue 8-bromo-7-methoxychrysin（BrMC），i. e.，8-nitrochrysin as an effective component of traditional Chinese medicine propolis，having the ability for inducing the differentiation of human hepatocarcinoma cells.MethodsThe human hepatocarcinoma HepG2 cells were cultured in vitro.The Wright s-Giemse mixed coloring method was adopted to detect the changes of the cellular morphology and the nuclear-cytoplasmic ratio of Hep G2 cells induced by BrMc；the changes of microtubules microfilament protein array of HepG2 cells induced by BrMC and all transretinoidacid（ATRA）wereobservedbyCoomassiebrilliantblue staining；the contentsof alkaline phosphatase（ALP）andgammaglutamyl transpeptidase（γ-GT）in HepG2 cells were detected by the enzyme catalyzed reaction；the radioimmunoassay（RIA）was used to detect the mass fraction of alpha fetal protein（AFP）；the content of tyrosine transaminase（TAT）was measured by the Diamondstone spectrophotometry.ResultsThe cytoplasmic ratio by 1.0 ug/mL BrMC handled was far lower than that of solvent con trol group，the difference was statistically significant（P＜0.01）.1.0 μg/mL BrMC and ATRA handled 24，48，96 hours，the mass fraction of AFP，activity of γ-GT，ALP，TAT compared with the solvent control group respectively，the difference were statistically significant（P＜0.01）.ConclusionBrMC induces human hepatocarcinoma cellular differentiation by lowing the nucleus-cytoplasmic ratio，decreasing the secretion of AFP，effectively activating TAT and ALP in HepG2 cells；moreover BrMc and ATRA inhibiting the activity of γ-GT.

Plantextracts； Liver neoplasms/pathology； Tumor cells，cultured； 8-bromo-7-methoxychrysin（BrMC）；HepG2cells； Differentiation； Induce

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.19.002

A

1009-5519（2015）19-2892-04

2015-05-05）

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本刊编辑部

湖南省中医药管理局项目（201140）。

何贵成（1987-），女，湖南衡阳人，硕士研究生，主要从事临床实体瘤的诊治与防治工作；Email：313397526@qq.com。

艾小红（E-mail：1163504926@qq.com）。