杨景哲，陈凤平，冯欣姝，温海玲，耿琪瑛

(承德医学院附属医院烧伤整形科，承德 067000)

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对深Ⅱ度烫伤模型大鼠创面愈合的影响*

杨景哲，陈凤平，冯欣姝，温海玲，耿琪瑛

(承德医学院附属医院烧伤整形科，承德 067000)

目的 研究外用重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)对深Ⅱ度烫伤创面愈合的影响。方法 90只Wistar大鼠建立深Ⅱ度烫伤模型，分为A、B、C三组，每组30只。A组：凡士林纱布覆盖；B组：纳米银敷料覆盖；C组：rhGM-CSF涂抹创面。伤后第1，4，7，10，14，21天，观察创面病理学改变，按照酶联免疫吸附法测定血清中表皮生长因子(EGF)水平，运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测创面愈合过程中转化生长因子(TGF)-β1mRNA表达的变化。结果 病理学改变：A、B、C三组均在第10天出现明显的上皮化；EGF水平逐渐上升，A组上升最慢，C组上升最快，第1，4天各组间及第7天A组与B组差异无统计学意义(P>0.05)，第7天其余各组间及第10，14，21天各组间差异均有统计学意义(均P<0.05)；TGF-β1mRNA相对表达量，A组、B组逐渐上升，C组在第14天达到峰值，第21天下降，第1天，B组与C组之间差异有统计学意义(P<0.05)，第4天各组间差异无统计学意义(P>0.05)，第7，10，14，21天各组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论 rhGM-CSF可加速深Ⅱ度烫伤创面愈合。

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；纳米银；烧伤创面；表皮生长因子；转化生长因子

烧(烫)伤是常见的机体损伤，而深Ⅱ度烧伤创面的修复一直是烧伤科医生关注的重点。创面外用药物不仅要求使用方便、安全、药物吸收快、不良反应小，更要具有加速创面愈合的特点。纳米银、重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，rhGM-CSF)在烫伤临床治疗中已广泛应用，为探讨二者在深Ⅱ度烫伤创面上皮化方面的优势，笔者在本实验中通过局部应用rhGM-CSF、纳米银，对烫伤大鼠血液表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)水平及组织转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)mRNA相对表达量的检测，为深Ⅱ度烫伤创面的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Wistar大鼠，体质量200～220 g，雌雄各半，天津山川红实验动物科技有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK(津)2009-0001，大鼠于实验室条件下的动物房内，温度为(24±3)℃，常规配方饲料喂养和饮自来水。

1.2 试药 纳米银医用抗菌敷料(深圳市爱杰特医药科技有限公司，批号：120401)；rhGM-CSF凝胶(长春金赛药业有限公司，批号：20120603)；水合氯醛(上海迈瑞尔化学技术有限公司，批号：30037517)，EGF试剂盒(武汉华美生物工程有限公司，批号：46036285)，PCR试剂盒(博瑞克生物技术有限公司，批号：081308)，逆转录试剂盒(Thermo公司，批号：00141145)。

1.3 仪器 UV2201型紫外分光光度计(日本岛津)，PTC-220PCR扩增仪(美国MJ公司)。

1.4 动物建模与分组 Wistar大鼠90只，建模前适应性喂养1周，治疗按照《国家卫生实验动物护理和使用指南》进行。腹腔注射浓度1%水合氯醛1 mL·kg-1麻醉，背部去毛后用99 ℃纱布覆盖10 s，造成约4 cm×4 cm深Ⅱ度烫伤创面(病理切片证实)。雌雄分开后，按照随机数字表法将大鼠随机分为3组，每组30只。A组：凡士林纱布覆盖。B组：0.9%氯化钠溶液湿润纳米银医用抗菌敷料覆盖，A组、B组敷料完全覆盖创面即可。C组：rhGM-CSF涂抹创面，每次涂抹约2 g。大鼠创面每天换药，分别于伤后第1，4，7，10，14，21天留取1 cm×1 cm皮肤标本，留取血液标本一份，约3 mL，至第21天，终止实验。

1.5 创面病理观察 创面换药时观察创面不同时间愈合情况，创面组织标本在苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色下观察创面上皮化程度。

1.6 EGF检测 解冻血清标本，按照酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno-sorbent assay，ELISA)法测定各标本血清中EGF水平，按照试剂盒说明书操作。

1.7 TGF-β1mRNA水平的检测 将组织标本按10 cm2·mL-1比例加入Trizol，用Trizol总RNA 提取试剂盒提取细胞总RNA，经紫外-可见分光光度计测定总RNA 浓度和纯度，重复测定3次，A260和A280之比值应为118～210，计算样品总RNA 浓度。引物序列为：TGF-β1cDNA扩增的上游引物5′-GTGGCTGAACCAA-GGAGACG-3′，下游引物5′-CGGTGTTGAGCCC-TTTCCAG-3′，产物片段长度为196 bp；β-actin上游引物5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游引物5′-ACTCACATCTGCTGGAAGG TGGAC-3′，扩增片段长度220 bp。取总RNA 1 μg，加入Oligo(dT)18 Primer，70 ℃温育5 min；迅速放入冰浴中，加入10 mmol·L-1dNTP，RNA酶抑制剂，5×缓冲液，42 ℃温育5 min；冰浴中加入5 U·μL-1AMV逆转录酶，加入焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate,DEPC)处理水至总体积20 μL，42 ℃温育60 min，70 ℃10 min，立即置冰上，-80 ℃冰箱保存备用。将反应管置于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪上，95 ℃预变性10 min后，进入95 ℃变性1 min，50 ℃退火15 min，72 ℃延伸10 min 的循环，共34次，最后72 ℃充分延伸10 min。反应完成后取PCR 反应液10 μL，经1%琼脂糖凝胶电泳，用PCR Marker 作分子量标准。电泳完毕后在紫外荧光数字成像仪下观察结果。以每例TGF-β1与β-actin扩增产物条带吸光度的比值作为TGF-β1mRNA的相对表达量。

1.8 统计学方法 运用SPSS16.0版统计软件进行统计学分析。各组间不同时相点EGF、TGF-β1mRNA相对表达量采用F检验，不同时相点组内两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 创面病理学表现 A、B、C三组均在第10天出现明显的上皮化，A组创面伤后红肿明显，并且在第14天出现痂下积脓，上皮化进程缓慢；B组创面伤后红肿，上皮化进程较A组明显加快；C组创面伤后上皮化进程最快。伤后第14天，A组创面仍处于溶痂阶段，炎症反应明显，B组创面已出现部分上皮化，C组创面大部已上皮化。见图1。

2.2 血清EGF水平 A组、B组、C组EGF水平在伤后均持续逐渐上升，A组上升速度最慢，C组上升速度最快，第1，4天各组间差异无统计学意义(P>0.05)，第7天A组与B组比较差异无统计学意义(P>0.05)，第7天其余各组间及第10，14，21天各组间均差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1。

图1 3组大鼠烫伤后第14天创面上皮化情况(HE，×200)

表1 3组深Ⅱ度烫伤大鼠血液EGF水平

Tab.1 Serum EGF levels of three groups of rats with deep second-degree burn

组别第1天第4天第7天第10天第14天第21天A组0．48±0．170．48±0．130．52±0．090．59±0．100．63±0．120．72±0．14B组0．50±0．100．51±0．110．58±0．110．67±0．14∗10．81±0．11∗10．93±0．13∗1C组0．52±0．080．54±0．120．65±0．13∗1∗20．78±0．12∗1∗20．96±0．10∗1∗21．18±0．16∗1∗2

A、B、C组间F检验，第1，4天，P>0.05，第7，10，14，21天，P<0.05；两两比较SNK-q检验，第7，10，14，21天，与A组比较，*1P<0.05，与B组比较，*2P<0.05

Ftest among group A,group B and group C at d1,d4,P>0.05,at d7, d10, d14 and d21,P<0.05; pairwise comparison by SNK-q test at d7, d10, d14 and d21;compared with group A，*1P<0.05；compared with group B，*2P<0.05

2.3 TGF-β1mRNA的表达水平 计算每例TGF-β1与β-actin条带吸光度比值作为TGF-β1mRNA相对表达量。A组、B组TGF-β1mRNA相对表达量持续逐渐上升，而C组在第14天达到峰值，第21天下降。第1天，B组与C组比较差异有统计学意义(P<0.05)，第4天各组间差异无统计学意义(P>0.05)，第7，10，14，21天各组间差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

烫伤治疗过程中创面治疗是重要的环节，愈合过程及预后一直是临床关注的重点。深Ⅱ度烫伤创面治疗过程中，可能因创面溶痂、感染，影响愈合，尤其是耐药菌的广泛出现，增加临床治疗的难度[1]，或是长时间不愈局部纤维化形成，预后瘢痕增生及反复再发创面可能，因而深Ⅱ度烫伤创面治愈的关键在于创面的上皮化进程。

rhGM-CSF 作为组织工程产物，局部外用可以调节上皮细胞及成纤维细胞的增殖和活化，趋化炎性细胞，诱导角质细胞增殖和迁移，促进创面的愈合[2-3]。rhGM-CSF在烧伤残余创面治疗上有独特的优势[4-5]，加速其上皮化进程，提高创面的愈合率，还能通过调节机体免疫系统，增强机体的免疫力[6]，增强机体抵抗深Ⅱ度烧伤创面因溶痂导致感染的能力，而临床治疗中多直接选择复方环丙沙星等抗菌药物对抗创面炎症反应[6]。烧伤创面存在大量基质金属蛋白酶，可使多种生长因子降解，不利于创面的愈合，而纳米银具有抑制基质金属蛋白酶的作用，此优点促进了创面的愈合[7-8]。但其缺点是吸水性差，对创面的黏附性强给换药工作带来一定的困难，对促进皮肤再生方面的作用有所欠缺。

实验结果表明，EGF水平在深Ⅱ度烫伤创面治疗过程中持续上升，与创面上皮化密切相关，A组水平上升最慢，上皮化速度最慢，B组水平居中，C组上升水平最快。而文献研究提示，猪脱细胞真皮在深Ⅱ度烫伤治疗应用过程中，EGF水平在第3天开始上升，第5天达峰值，之后开始下降[9]。TGF-β1mRNA相对表达量，A组、B组持续上升，C组在第14天达到峰值，第21天明显下降，TGF-β1是烫伤创面纤维化愈合瘢痕增生的主要作用因子，rhGM-CSF外用于创面，上皮化充分启动，促进创面愈合，同时，适度弱化TGF-β1在过度纤维瘢痕化方面的作用，减轻深Ⅱ度烫伤创面预后瘢痕增生的可能。rhGM-CSF和纳米银均能促进创面愈合，但是其作用机制不同，rhGM-CSF主要利用其趋化作用，活化多种促愈合细胞活性因子，如：EGF、TGF-β1、VEGF、PDGF、FGF等，加强趋化角质细胞，通过刺激新生角化上皮增殖、迁移、分化和存活，参与并加速创面的再上皮化，纳米银主要是抑制创面基质金属蛋白酶作用，减少细胞活性因子的降解。

EGF是一种多功能的生长因子，在体内、体外对多种组织细胞有强烈的促分裂作用，提高细胞内DNA拓扑异构酶活性，在创伤后上皮细胞生长方面发挥主要作用[10]。EGF具有促进上皮增殖、组织修复和细胞保护作用，随着细胞外基质的合成，上皮细胞增殖和分裂，诱导干细胞分化，进而促进创面愈合[11]。EGF在烧伤创面愈合的整个过程中均发挥重要作用，是促进创面上皮化的主要作用因子之一。本组实验结果提示：EGF在创面愈合中持续上升，尤其是C组，与rhGM-CSF外用活化细胞因子有关。TGF-β1相对分子质量约25 000，是细胞生长的多功能调节因子，能促进成纤维细胞的生长及细胞外基质的表达，诱导细胞因子的分泌，促进创伤的愈合。TGF-β1具有多种生物学特性，能诱导纤维母细胞的增生并促进其分裂成熟，对细胞增殖有双向调节作用，在烧伤、溶痂、修复不同阶段发挥着不同的生理功能[12]，细胞因子的活化能改变其水平变化，对烧伤后创面修复起到积极作用。随着胶原基质的沉积和上皮细胞再生，反馈机制通过下调TGF-β1的表达从而抑制信号转导通路，对smad蛋白家族的调节发挥作用[13]，抑制Ⅰ型胶原合成，减少成纤维细胞的过度增殖，从而在创面愈合的前提下抑制瘢痕的形成。本组实验第21天TGF-β1mRNA相对表达量下降，可能是rhGM-CSF调节TGF-β1的表达所致，提示rhGM-CSF参与组织重塑[14]。

表2 3组深Ⅱ度烫伤大鼠组织TGF-β1mRNA相对表达量

Tab.2 Relative expression of tissular TGF-β1mRNA in three groups of rats with deep second-degree burn

±s

A、B、C组间F检验，第4天，P>0.05，第1，7，10，14，21天，P<0.05；两两比较SNK-q检验，第1，7，10，14，21天，与A组比较，*1P<0.05；与B组比较，*2P<0.05

Ftest among group A,group B and group C at d4,P>0.05,at d1, d7, d10, d14 and d21,P<0.05; pairwise comparison by SNK-q test at d1,d7, d10, d14 and d21;compared with group A，*1P<0.05；compared with group B，*2P<0.05

rhGM-CSF和纳米银敷料外用均能加速深Ⅱ度烫伤创面愈合过程的上皮化进程[15]，但是rhGM-CSF优势更加明显，能否将二者联合应用，充分利用凝胶保湿和纳米银敷料的敷料架构作用，相关的系统性研究工作有待全面开展。

[1] 杜学娜，张岩，董爱英，等.秦皇岛两所医院2006-2010年金黄色葡萄球菌耐药性分析[J].医药导报，2013，32(1)：28-30.

[2] 刘继松，方勇，姚敏，等.重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对烫伤大鼠创面愈合及新生血管化的影响[J].蚌埠医学院学报，2012，37(1)：17-19.

[3] ZHANG L，CHEN J，HAN C.A multicenter clinical trial of recombinant human GM-CSF hydrogel for the treatment of deep second-degree burns[J].Wound Repair Regen，2009，17(5)：685-689.

[4] YAN H，CHEN J，PENG X.Recombinant human granulo-cyte-macrophage colonystimulating factor hydrogel promotes healing of deep partial thickness burn wounds[J].Burns，2012，38(6)：877-881.

[5] 杨晋峰.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子治疗烧伤残余创面的临床研究[J].医学综述，2011，17(10)：1554-1556.

[6] 万军梅，万明.复方环丙沙星烧伤凝胶抗菌作用与毒理学研究[J].医药导报，2013，32(2)：156-158.

[7] 赵志伟，雷晋，段鹏，等.斯丽凯纳米银抗菌凝胶治疗烧伤创面30例疗效分析[J].山西职工医学院学报，2009，19(2)：36-37.

[8] 刘焕亮，王慧杰，袭著革.纳米银的抗菌原理及生物安全性研究进展[J].环境与健康杂志，2009，26(8) ：736-739.

[9]CHEN X D，SHI Y，SHU B，et al.The effect of porcine ADM to improve the burn wound healing[J].Int J Clin Exp Pathol，2013，6(11)：2280-2291.

[10] HAN Y，SHAO Y，LIN Z H，et al.Netrin-1 simultaneously suppresses corneal inflammation and neovascularization[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2012，53(3)：1285-1295.

[11] 宗守凯，梁自乾，欧邦军.局部应用重组人EGF对糖尿病大鼠烫伤创面EGF受体及其mRNA表达的影响[J].中国修复重建外科杂志，2010，24(2)：150-155.

[12] LIU H，LIN S，XIAO D，et al.Evaluation of the wound healing potential of resina draconis(dracaena cochinchinensis) in animal models[J].Evid Based Complement Altemat Med，2013，ID：709865：8.

[13] ZHANG Z，FINNERTY C C，HE J.Smad ubiquitination regulatory factor 2 expression is enhanced in hypertrophic scar fibroblasts from burned children[J].Burns，2012，38(2)：236-246.

[14] 郭敏，崔文慧，黄宏，等.粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与创面愈合[J].创伤外科杂志，2011，13(3)：279-282.

[15] 杨景哲，温海玲，耿琪瑛，等.rhGM-CSF及纳米银对深Ⅱ度烫伤创面愈合过程血管化的影响[J].医药导报，2014，33(12)：1570-1574.

Effect of Recombinant Human Granulocyte/macrophage Colony Stimulating Factor on Wound Healing in Rat Model of Deep Second-degree Burn

YANG Jingzhe, CHEN Fengping, FENG Xinshu, WEN Hailing, GENG Qiyin

(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege,Chengde067000,China)

Objective To study the effect of recombinant human granulocyte/macrophage colony stimulating factor (rhGM-CSF) on wound healing in rat model of deep second-degree burn. Methods The burn model was established with Wistar rats.They were randomly divided into three groups, petrolatum treatment group (group A,n=30), nano-silver treatment group (group B,n=30), and rhGM-CSF treatment group (group C,n=30).Pathological changes of wound of the three groups were observed on the 1st, 4th, 7th, 10th, 14th, and 21st day after treatment.Meanwhile the concentration of epidermal growth factor (EGF) in serum was measured with ELISA, and TGF-β1mRNA expression was detected by RT-PCR. Results Epithelization was observed in all the groups on the 10th day after treatment.EGF level increased gradually, and it increased most slowly in group A, and fastest in group C.There was no significant difference in EGF level among the groups on the 1st and 4th days, and between group A and B on the 7th day (P>0.05).But there was significant difference in in EGF level between group A and C, between group B and C on day 7, and among the groups on day 10, 14 and 21, respectively (P<0.05).Relative expression of TGF-β1mRNA was gradually increased in group A and group B, and peaked on day 14 and decreased on day 21 in group C.There was significant difference between group B and group C on day 1 (P<0.05), no significant difference on day 4 (P>0.05) and significant difference among the groups on day 7, 10, 14 and 21 (P<0.05). Conclusion rhGM-CSF treatment can accelerate healing of burn wound.

Recombinant human granulocyte-macrophage colony stimulating factor ; Nano silver; Burn wound; Epidermal growth factor; Transforming growth factor

2014-01-21

2014-06-11

*承德市科学技术研究与发展计划项目(20122164)；河北省2013年医学科学研究重点课题计划指令性课题(20130024)

杨景哲(1980-)，男，河北承德人，主治医师，硕士，主要从事烧伤创面愈合机制研究。电话：0314-2279277，E-mail：sanyue_1@sina.com。

陈凤平(1970-)，并列第一作者，女，满族，河北承德人，主管护师，学士，研究方向：深度烧伤创面的治疗对策与护理。电话：(0)15930992842，E-mail：sanyue_1@sohu.com。

冯欣姝(1971-)，女，回族，河北承德人，副主任护师，硕士，研究方向：烧伤难愈性创面治疗和护理。电话：0314-2279276，E-mail：sanyue_1@aliyun.com。

R965

A

1004-0781(2015)02-0153-05

DOI 10.3870/yydb.2015.02.003