刘欣伟，柳云恩，张玉彪，訾 英，安 舒，周大鹏，项良碧，侯明晓

1.沈阳军区总医院骨科，辽宁沈阳 110016;2.沈阳军区总医院全军重症战创伤实验室，辽宁沈阳 110016;3.解放军第463医院急诊科，辽宁沈阳 110042;4.沈阳军区兴城疗养院医务部，辽宁兴城 125100

脊髓损伤是指由于外界直接或间接因素导致脊髓的损伤。目前对脊髓损伤的治疗都局限于创伤早期，以手术治疗为主，恢复脊柱的稳定性。但脊髓损伤后的神经功能恢复多不佳，亦会发生一系列的原发性和继发性病理生理改变［1-2］。褪黑素(melatonin，MT)对脊髓氧化性损害的保护作用逐渐被认识，但对脊髓细胞凋亡及锌转运体的影响报道较少。本研究通过观察褪黑素对大鼠脊髓损伤后细胞凋亡及锌转运体1(Zn Transporter 1，ZnT1)表达情况的影响来探讨其对脊髓损伤的保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康成年雄性SD大鼠54只，体重200～240 g，由沈阳化工学院新药安全评价中心动物部提供，许可证号:SYXK(辽)2006-0002。

1.1.2 试剂及仪器 褪黑素(北京索来宝公司)、TUNEL凋亡检测试剂盒(ROCHE公司)、免疫组化染色试剂盒及一抗ZnT1多克隆抗体(北京索来宝公司)。低温冰箱(日本三洋公司)、电子天平及干燥箱(上海民桥科学精密仪器公司)、冰冻切片机(德国莱卡公司)、光学及倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)、离心机(德国西格玛公司)、垂直板电泳转移装置(美国GE公司)、冷凝胶成像系统(美国GE公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 将大鼠随机分为3组，即假手术组、损伤组、褪黑素组，每组18只。

1.2.2 模型的建立及取材 将SD大鼠以水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后，备皮、常规消毒。取大鼠背部正中线作为脊柱体表投影，以T12椎体水平为中心点纵向切开皮肤、皮下组织，长约2 cm。在手术显微镜下通过显微外科手术器械，将大鼠棘突、椎板咬除，保留完整的硬脊膜(假手术组到此处结束手术、关闭切口)。应用钳夹法以血管夹钳夹T12水平硬膜囊1 min，对显露的脊髓组织造成损伤，损伤后观察大鼠 BBB(Basso，Beattie and Bresnahan score)评分［3］，评分≤1即证实建模成功(损伤组到此处结束手术)。生理盐水冲洗伤口，对活动性出血进行止血，以0号丝线全层缝合、关闭切口。在实验组中，建模成功后即刻将褪黑素溶于无水乙醇溶剂中，然后用生理盐水将溶液中乙醇浓度稀释到5%以下，100 mg/kg对大鼠腹腔注射，1次/d。术后正常进食进水，人工辅助膀胱压迫排尿3次/d。术后12、24、48 h，每个时间点每组取6只大鼠处死，取T11-L1节段长约1 cm脊髓组织，以10%中性甲醛缓冲液固定，待固定完全后进行脱水、包埋、切片。

1.2.3 检测方法 (1)HE染色。(2)DNA断裂的原位末端标记法(Tunel法)检测细胞凋亡。(3)通过免疫组化(immunohistochemistry，IHC)及蛋白质印迹法(Western-blot，WB)检测ZnT1表达情况。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(±s)表示，多组数据间的比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果 光学显微镜下，可以观察到假手术组组织结构完好，细胞形态未发生明显变化，神经元较大，细胞核形态清晰，位置居中，胞质富匀。损伤组可见部分神经元受损，存在细胞胞体膨大、结构不清晰，组织间隙充血，核缩且结构不清，凋亡小体存在。褪黑素组中，病理组织结构及细胞形态较损伤组得到一定程度的改善。见图1。

图1 3组大鼠术后48 h脊髓神经元情况(HE×40)

2.2 Tunel法检测细胞凋亡情况 Tunel染色结果提示，凋亡的细胞镜下表现为棕褐色或黄色，核缩、染色颗粒颜色较深，形态较不规则且散漫分布于损伤的范围内，其中假手术组凋亡较少，损伤组凋亡率最高;在12、24、48 h损伤组的凋亡率较假手术组明显增高，差异有统计学意义(P＜0.05)，褪黑素组的细胞凋亡率较损伤组则明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1，图2。

表1 不同时间3组大鼠脊髓细胞凋亡率比较(±s)

表1 不同时间3组大鼠脊髓细胞凋亡率比较(±s)

注:与假手术组比较，a P＜0.05;与损伤组比较，b P＜0.05。

48 h组别 n 凋亡率(%)术后12 h 术后24 h 术后假手术组6 16.18±1.51 18.14±2.16 17.33±1.76损伤组 6 68.31±5.12a 61.22±3.98a 53.38±4.25a褪黑素组 6 51.35±2.93ab 41.92±2.12ab 33.67±3.29ab

图2 3组大鼠术后48 h脊髓细胞凋亡情况(TUNEL×100)

2.3 ZnT1的表达情况 免疫组化染色结果显示，术后48 h各组中均可见ZnT1表达，其中在褪黑素组中表达最明显，在损伤组中表达较假手术组增加不明显。见图3。

图3 3组大鼠ZnT1术后48 h时阳性细胞情况(IHC×40)

2.4 WB检测结果 WB检测不同时间褪黑素组ZnT1的表达情况，发现褪黑素干预后，褪黑素组ZnT1表达较假手术组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图4。

图4 褪黑素组中ZnT1随时间变化的情况

3 讨论

脊髓损伤是非常严重的疾病，多见于交通伤和战伤等，在损害的相应节段出现相应的运动、感觉和括约肌功能障碍、肌张力异常及病理反射等改变［4-5］。目前，对脊髓损伤的治疗都仅局限于创伤早期，以手术治疗为主，尽早地解除对脊髓的压迫，恢复脊柱的稳定性。但脊髓损伤后的神经功能恢复多不佳，预后也难以预料，因为脊髓损伤后的病理生理机制非常复杂。脊髓损伤后会发生一系列的原发性和继发性病理生理改变，包括脊髓水肿、氧自由基、神经递质、神经肽以及多种酶活动的改变等［6-7］。这些病理改变和相关酶类及生长因子的变化会对脊髓损伤后的神经功能产生重要的影响。近年来，随着对脊髓损伤机制的研究不断深入，脊髓组织水肿的作用逐渐引起重视。减少或阻断脊髓水肿成为治疗脊髓损伤的有效方法之一。目前，临床一线治疗药物中的甲泼尼龙就有此类作用，但其不良反应明显。

褪黑素是松果体分泌的一种神经内分泌激素，具有广泛的生理功能，不仅参与调节昼夜节律及生殖、甲状腺、肾上腺等功能，还具有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等作用，参与机体许多病理生理过程。目前褪黑素对脊髓氧化性损害的保护作用逐渐被认知。既往研究中，褪黑素被证实可以保护氧自由基导致的核酸破坏［8］。褪黑素可以通过直接清除羟自由基、过氧化氢等组成的活性氧自由基，而达到强大的抗氧化作用，对脊髓损伤后神经功能恢复的作用也经相关研究得到了验证［9］。但对褪黑素抑制急性脊髓损伤后脊髓组织水肿的作用机制还有待进一步研究。

锌是机体必需的重要微量元素。研究表明，锌是机体多种酶的必需组分或激活因子，与机体发育、骨骼生长、免疫功能、内分泌调节、蛋白质和核酸代谢等一系列生理活动密切相关，补充锌能够抑制或减轻一些神经细胞的凋亡［10-11］。相反，锌缺乏能够加重凋亡或加重脊髓损伤［12］。文献证实，脊髓损伤后患者普遍存在不同程度的锌缺乏以及血锌丢失，而适当增加锌含量则对脊髓损伤具有保护作用［13-14］。本研究推测褪黑素能够增加细胞内锌含量进而增加神经相关生长因子的表达，而这可能是褪黑素发挥对脊髓损伤后神经保护作用的机制之一。但锌离子不能自由通过细胞膜，需要特定的转运蛋白和膜通道参与转运和代谢。锌转运体主要包括Slc39a/ZiP和Slc30a/ZnT两大类，在锌离子转运过程中发挥重要作用［15］。ZiP蛋白家族能够促进锌离子从细胞外或细胞器的内室涌入到细胞质中［16］。相反，ZnT家族成员能够从胞质去除锌离子，包括排入胞外或流入管腔小泡和细胞器内［17］。本研究结果表明，褪黑素有利于损伤的脊髓组织修复，加之锌对于脊髓的保护是有利因素，褪黑素提高ZnT的表达后，利于增加细胞内锌含量，进一步起到脊髓保护的作用。

本研究表明，急性脊髓损伤后会出现明显的脊髓组织病理改变，褪黑素干预可以减轻受损脊髓的损伤程度，使ZnT的表达上调。笔者推测，褪黑素影响ZnT表达是其发挥脊髓保护作用的机制之一，但其具体作用机制及信号通路尚有待进一步研究。

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