奚 蕾 应明真 曹向明 沈伟生 王雅杰 刘宝瑞



APE1在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及其与预后的关系

奚 蕾 应明真 曹向明 沈伟生 王雅杰 刘宝瑞

目的 了解脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE1)在乳腺浸润性导管癌组织中的表达情况，分析其与患者临床病理学参数之间的关系，探讨APE1蛋白表达与乳腺浸润性导管癌患者预后的关系。方法 收集2002年1月～2012年12月东南大学附属江阴医院，第二军医大学附属长海医院经治的病理确诊的乳腺浸润性导管癌患者组织标本133例。免疫组化法检测癌组织中APE1蛋白表达情况，并对其与临床病理参数的相关性进行分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比较采用Log-rank检验。结果 133例患者失访14例，有效随访病例为119例。患者中位年龄53岁， APE1蛋白阳性表达者96例(72.18%)，阴性表达者37例(27.82%)。APE1蛋白阳性表达和雌激素受体状态、Her2表达以及分子分型相关(P<0.05)，和年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移及组织学分级无关(P>0.05)。生存分析提示APE1蛋白阴性患者的总生存时间(OS)优于阳性表达患者(P<0.05)。结论 乳腺浸润性导管癌患者APE1蛋白表达与雌激素受体表达、Her2表达、分子分型相关。相比于APE1阴性表达患者，阳性表达提示预后不良。

脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1 乳腺浸润性导管癌 预后

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其中浸润性导管癌是乳腺癌最常见的病理类型。近年来，乳腺癌在我国的发生率呈逐年上升趋势。目前乳腺浸润性导管癌的主要治疗手段包括手术、放化疗、分子靶向治疗和内分泌治疗等，有很多研究探讨乳腺癌的基因治疗，尝试寻找新的基因作为靶点来提高治疗效果。脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1，APE 1)已经被证实存在于多种恶性肿瘤组织中，是脱嘌呤/嘧啶(apurinic/apyrimidinic，AP)内切酶的主要活性部分，APE1的表达增高和肿瘤的发生、发展以及预后有着密切的关系[1]。有研究证实，乳腺浸润性导管癌的放化疗耐受与肿瘤组织DNA损伤修复过程密切相关，APE1作为关键酶参与DNA碱基切除修复途径(base excision repair BER)，起到了耐受DNA损伤的重要作用[2，3]。因此，针对APE1的分子靶向治疗或许能使乳腺浸润性导管癌放化疗耐受成为可能。本研究旨在探讨APE1在乳腺浸润性导管癌组织中的表达情况及其与预后的关系，为进一步的研究提供临床病理依据。

资料与方法

1.一般资料：收集2002年1月～2012年12月东南大学附属江阴医院，第二军医大学附属长海医院经治的病理确诊的乳腺浸润性导管癌癌患者组织标本133例，患者年龄31～84岁，中位年龄53岁。所有患者均接受了规范、系统性的局部和(或)全身治疗，包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗等。收集和整理全部乳腺癌患者的临床、病理资料，按照年龄、TNM分期、激素受体状态、组织学分级、近似分子分型等指标进行分类统计分析。

2.免疫组织化学方法：133例乳腺癌浸润性导管癌组织及癌旁正常组织石蜡标本切片后应用En-vision免疫组织化学法检测APE1的表达情况，鼠抗人APE1单克隆抗体购于Santa Cruz公司(1∶200)，严格按照试剂盒说明书进行操作，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照，用已知阳性切片做阳性对照。

3.结果判定：病理结果判读采用双盲法，分别由两位高年资的病理专科医生独立判定结果，当出现判定结果不一致时需要进行复判，最终确定结果。APE1阳性产物定位于细胞质和(或)细胞核。二级计分法用于阳性细胞结果判定，根据细胞染色阳性率和染色强度结果综合判断计分，具体标准如下，细胞染色阳性率：≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；染色强度计分：阴性为不着色计0分，弱阳性(+)为淡棕黄色计1分，强阳性(+++)为深棕褐色为计3分，强阳性和弱阳性之间为(++)计2分。两者分值相乘得到总分，5～12分定义为阳性，0～4分为阴性。

4.随访：对象为纳入研究的133例浸润性导管癌患者，随访时间从病理确诊之日开始算起。其中失访14例，有效随访119例。中位随访时间为85个月，死亡24例。随访截止时间为2014年10月。

5.统计学方法：应用SPSS 19.0软件进行统计分析，分类变量相关性分析使用χ2检验。采用Kaplan-Meier法评估乳腺癌患者生存率，使用Log-rank检验对组间生存率曲线进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.乳腺浸润性导管癌组织中APE1表达情况：根据二级计分法，纳入本研究的133名乳腺浸润性导管癌患者中，癌组织APE1表达阳性率显著高于癌旁正常组织，差异具有统计学意义(P=0.000，表1)。在癌组织APE1表达阳性患者中，7.29%(7/96)为胞质表达阳性为主，其余均主要为胞核表达阳性(图1)。

表1 乳腺浸润性导管癌组织与癌旁正常组织APE1蛋白的表达比较

图1 APE1在乳腺浸润性导管癌中的表达A.强阳性;B.弱阳性;C.阴性

2.APE1表达与乳腺浸润性导管癌患者临床病理学参数之间的相关性：研究结果显示，乳腺浸润性导管癌组织APE1的表达和组织雌激素受体(ER)表达、孕激素受体(PR)表达、人类表皮生长因子受体2(Her2)表达以及分子分型相关，与年龄、肿瘤大小、有无淋巴结转移及组织学分级不相关。ER表达阳性、PR表达阳性或Her2表达阴性的乳腺浸润性导管癌表达APE1的阳性率高。在分子分型中，Luminal A型浸润性导管癌患者APE1表达的阳性率高(表2)。

3.APE1表达与预后的关系：119例乳腺浸润性导管癌患者的中位OS为85个月。其中，APE1阳性患者的中位OS为85个月，APE1阴性患者的中位OS为93个月。经过Log-rank检验分析显示两组间生存率的差异具有统计学意义(χ2=3.919，P=0.048,图2)。乳腺浸润性导管癌APE1表达阴性患者与APE1表达阳性的患者相比具有更好的OS。

表2 乳腺浸润性导管癌中APE1蛋白的表达与患者临床病理学参数之间的关系

图2 APE1表达和生存时间的关系

讨 论

APE1基因包括4个内含子和5个外显子，定位在14号染色体长臂11.2～12区。研究表明APE1在正常组织中也有表达，且表达的胞内定位存在差异。在多数正常组织中APE1表达定位于胞核，而在一些高增殖率的细胞如淋巴细胞、肝细胞中，APE1可呈现胞质定位[4]。在恶性肿瘤组织中，APE1的表达出现增强，Yang等[5]发现恶性黑色素瘤细胞系的APE1蛋白水平高出正常黑色素细胞数倍。至于恶性肿瘤细胞中APE1表达的胞内定位，Sheng等[6]发现卵巢癌组织中常呈现胞核、胞质共同表达，且胞质表达常提示预后不佳。Kim等[7]对结肠癌的APE1表达研究也得到了类似的结果。在本研究中，笔者发现133例乳腺浸润性导管癌患者的癌组织有72.18%呈APE1阳性表达，显著高于癌旁正常组织(3.76%)，但是癌组织中仅有7例是胞核、胞质共表达，其余均为胞核表达。受限于本研究中胞核胞质共表达患者例数较少，且目前APE1表达定位的生物学机制和其相关影响仍不明确，故仍需要更深入的研究去揭示其原因。

本研究发现APE1在乳腺浸润性导管癌中的表达与ER、PR、Her2表达及分子分型相关，与年龄、肿瘤大小、是否有淋巴结转移及组织学分级不相关。笔者推测APE1可能与ER、PR、Her2存在交互作用，参与细胞生物学行为的调节。就ER而言，Curtis等通过对一株乳腺癌细胞株的研究发现，APE1可以与ER发生相互作用，还可以增强ERɑ与含雌激素反应元件(ERE)的DNA的结合，且这些效应均是借助于APE1的氧化还原能力实现的。而APE1与PR、Her2的相互作用方式尚未见诸报道。近年来，肿瘤内部异质性相关的探索成为了肿瘤领域的新热点[8]。现有研究发现，同一患者肿瘤病灶内的细胞之间存在差异，这种差异体现在从基因水平到蛋白水平的各个方面，并且这种差异会随着肿瘤的进展与治疗的干预发生动态变化。对于乳腺癌而言，Her2蛋白的表达情况已经被证实并非一成不变。由此笔者推测，APE1作为可能与Her2发生相互作用的蛋白之一，或许同样存在伴随肿瘤发展及治疗干预而发生动态变化的现象，相信这必将是值得后续深入研究探讨的新课题。

通过生存分析，笔者发现APE1在乳腺浸润性导管癌中的表达与预后相关，APE1阳性表达患者的预后差于阴性表达患者。目前的研究已经证实APE1蛋白兼具有AP内切酶活性和转录因子激活能力。APE1占AP内切酶活性总体的95%，是DNA碱基切除修复(BER)的限速酶。而BER作为DNA烷化剂及辐射损伤后的主要修复方式，其能力的强弱与肿瘤细胞的放化疗耐受相关。因此研究者推断，APE1的阳性表达可能导致肿瘤细胞放化疗耐受的形成，进而影响患者预后。另外，除AP内切酶活性，APE1还具有激活多种转录因子的能力。APE1的N端区域为氧化还原结构域，通过氧化还原可以激活NF-kappaB、ATF、myb、Pax、HIF-α等。有研究证实APE1的氧化还原功能对维持和促进卵巢癌细胞的增殖具有重要作用，运用APE1的低分子抑制剂E3330可以明显抑制卵巢癌细胞的增殖。因此笔者推测，除了参与DNA修复诱导放化疗耐受，APE1的氧化还原活性同样对促进乳腺浸润性导管癌细胞增殖具有重要意义，这可能也是APE1阳性表达患者预后不佳的原因之一。

笔者发现APE1在乳腺浸润性导管癌组织中的阳性率显著高于癌旁正常组织。癌组织APE1表达情况和雌孕激素受体的表达、Her2的表达及分子分型相关，提示APE1可能与这些受体及相应信号通路间存在一定的交互作用。笔者同时还发现APE1阳性表达的乳腺浸润性导管癌患者的预后比阴性表达者差，推测其可能与APE1诱导的治疗耐受相关，这些现象的内在机制仍有待于进一步研究探索，可考虑进一步扩大样本量来验证APE1对预后价值。

1 Yang S, Meyskens FL. Apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox effector factor-1(APE/Ref-1): a unique target for the prevention and treatment of human melanoma[J]. Antioxid Redox Signal，2009,11(3):639-650

3 Tell G,Quadrifoglio F,Tiribelli C,etal.The many functions of APE1/Ref-1:not only a DNA repair enzyme[J]. Antioxid Redox Signal， 2009 ,11(3):601-620

4 Luo M, He H, Kelley MR,etal. Redox regulation of DNA repair: implications for human health and cancer therapeutic development[J]. Antioxid Redox Signal， 2010,12(11):1247-1269

5 Yang S, Irani K, Heffron SE,etal. Alterations in the expression of the apurinic/apyrimidinic endonuclease-1/redox factor-1 (APE/Ref-1) in human melanoma and identification of the therapeutic potential of resveratrol as an APE/Ref-1 inhibitor[J]. Mol Cancer Ther， 2005,4(12):1923-1935

6 Sheng Q, Zhang Y, Wang R,etal. Prognostic significance of APE1 cytoplasmic localization in human epithelial ovarian cancer[J]. Medical Oncology，2012，29(2):1265-1271

7 Kim JS, Kim JM, Liang ZL,etal. Prognostic significance of human apurinic/apyrimidinic endonuclease (APE/Ref-1) expression in rectal cancer treated with preoperative radiochemotherapy[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys，2012,82(1):130-137

9 Burrell RA, McGranahan N, Bartek J,etal. The causes and consequences of genetic heterogeneity in cancer evolution [J]. Nature，2013，501(7467):338-345

(修回日期：2015-03-16)

Expression of APE1 in Breast Invasive Ductal Carcinoma and Its Relationship with Prognosis.

XiLei,YingMingzhen,CaoXiangming,etal.

NanjingMedicalUniversity,Jiangsu210029,China

Objective To understand the expression of APE1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1) in breast invasive ductal carcinoma, analyze the intrinsic relationship between APE1 expression and clinical pathological data, and evaluate the prognosis with Pro APE1. Methods Data from 133 patients diagnosed with breast invasive ductal carcinoma between January 2002 and December 2012 in Jiangyin Hospital Affiliated to Southeast University Medical School and Changhai Hospital of Second Military Medical University were reviewed retrospectively.The expression of Pro APE1 was tested with Immunohistochemistry method, and a correlation analysis with pathological data was made. Survival function was done withKaplan-Meierestimator, the survival distributions withLog-ranktest was and compared. Results We missed 14 patients at the end of study and median age of the rest patients was 53 years old. 96 of them manifested positive Pro APE1 expressing (72.81%) and 37 of them manifested negative APE1 expressing (27.82%).Estrogen receptor positive (P<0.05), HER-2 positive (P<0.05), the molecular typing (P<0.05) were statistically related to Pro APE1, while age (P>0.05), size of tumor (P>0.05), lymph node situation (P>0.05), and historical stage (P>0.05) were not significantly related. Survival function shows that patients with negative Pro APE1 expressing had a longer OS than who had positive expressing (P<0.05). Conclusion Expression of geneAPE1in invasive ductal breast cancer was associated to estrogen receptor, HER-2 and molecular typing. Compared with patients of APE1 negative expressing, patients of APE1 positive expressing suggested a poor prognosis.

Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1); Breast invasive ductal carcinoma; Prognosis

210029 南京医科大学 (奚蕾、曹向明、沈伟生);210008 南京医科大学附属鼓楼医院肿瘤中心(刘宝瑞)；200433 上海，第二军医大学附属长海医院肿瘤科(应明真、王雅杰)

刘宝瑞，教授，主任医师，博士生导师，电子信箱：baoruiliu@nju.edu.cn

R73

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.032

2015-01-15)