夏世金 邰先桃 李 炳 苏晋燕 狄 桦 刘露梅 万文斌 胡明冬

·论著·

低氧性肺动脉高压小鼠肺的环状RNA表达谱研究

夏世金1邰先桃2李 炳3苏晋燕2狄 桦2刘露梅1万文斌4胡明冬5

目的采用环状RNA(circRNA)芯片筛选低氧性肺动脉高压(HPH)小鼠肺组织中差异表达的circRNA，分析circRNA表达谱特征，为HPH发生机制提供研究方法。方法20只健康雄性C57BL/6小鼠(体质量17～20 g)按数字表法随机分为HPH模型组与常氧组，每组10只。HPH模型组小鼠置于自制常压低氧舱内，舱内氧浓度(10±0.5)%O2。每天连续低氧处理8 h，连续21 d。常氧组小鼠置于常氧环境饲养。通过测定右心室收缩压和右心肥大指数验证HPH小鼠模型复制成功后，处死小鼠，取肺组织，用circRNA芯片检测各组肺组织circRNA表达谱，并进行组间比较与分析，以明确差异表达的circRNAs。结果与常氧组比较，HPH模型组肺组织中表达显著上调的circRNAs共有23个(P<0.01，P<0.05)；表达显著下调的circRNAs共有41个(P<0.01，P<0.05)。结论circRNA芯片可用于筛选HPH差异表达的circRNA，circRNA可能参与HPH调控机制。

环状RNA； 低氧性肺动脉高压； 小鼠； 肺； 芯片； 非编码RNA； 可变剪接； 微小RNA

低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是高致死率和高致残率的病理生理综合征，被认为是“假恶性”肿瘤[1]，严重危害患者的生命。有关HPH机制理论可归纳为肺血管结构重建学说等，治疗策略有降低肺动脉压力等[2]。而目前尚没有治疗HPH的特效方法，归因于HPH机制尚未完全阐明，甚至还没有可靠的临床生物学标志物，不能进行早期诊断与治疗。经典遗传学在研究HPH机制方面尽管取得一些进展，但遭遇困境，而近年盛行的表观遗传学将带来希望，尤其是环状RNA(circular RNA，circRNA)有可能为阐明HPH的机制、寻求早期干预靶点与确立可用于临床早期诊断的生物学标志物等提供突破口。

circRNA是新近确认的一类特殊的非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)分子，是继微小RNA(microRNA,miRNA)后RNA家族的一颗极具发展潜力的正在升起的新星，也是RNA领域最新的研究热点。通过与疾病关联的miRNA相互作用，circRNA在疾病的发生发展中发挥着重要的调控作用[3]。研究发现，小脑变性相关蛋白1反义转录物(antisense to the cerebellar degeneration-related protin 1 transcript, CDR1as)是一种circRNA，吸附miR-7，影响miR-7靶基因的活性[4-5]。CDR1as可能与帕金森病有关[6]。睾丸特异性基因Sry的circRNA可吸附miR-138，充当miR-138海绵[4]。circRNA cANRIL能影响动脉粥样硬化的发生[7]。

那么，circRNA是否具有调控HPH发生的机制，目前尚不明确。因此 ，本试验建立HPH小鼠模型，创新性使用circRNA芯片检测HPH小鼠肺组织中circRNA表达，分析其特异表达的circRNA，研究其circRNA表达谱特征，为阐明HPH发生机制、干预靶标和早期生物学诊断标志物提供依据，具有重要的理论意义和应用价值。

材料与方法

一、主要试剂

TRIzol®试剂(Invitrogen life technologies)；氯仿、异丙醇(上海化学试剂有限公司)和100% 乙醇(上海化学试剂有限公司)；75% 乙醇 (以DEPC处理的水配制)；无RNA酶的水和无RNA酶的糖原(Invitrogen life technologies)；Arraystar Mouse circRNA Microarray(6×7 K，美国Arraystar公司)，包含1797个circRNAs。实验由上海康成生物工程有限公司负责完成。

二、动物与实验方法

1. 动物与分组：20只健康雄性C57BL/6小鼠(购自上海杰思捷动物有限公司)，体质量17～20 g，按随机数字表法分为2组：HPH模型组与常氧组，每组10只。遵循实验动物使用相关条例和取得实验动物伦理委员会批准后进行本实验，在复旦大学附属金山医院中心实验室完成动物实验。

2. HPH模型制备：HPH模型组小鼠置于常压低氧舱内，控制舱内氧浓度在(10±0.5)%O2。每天连续低氧处理8 h，连续21 d。期间除更换垫料与添加食物饮水外，尽量不开启舱门。常氧组小鼠置于常氧环境饲养。

3. 取材：通过测定右心室收缩压和右心肥大指数验证HPH小鼠模型复制成功后，处死小鼠，快速取出肺脏，生理盐水冲去肺脏淤血，取肺组织，置于液氮备用。每组随机取3只小鼠肺组织进行circRNA芯片实验。

4. circRNA芯片实验操作流程：①样本RNA提取 ；②RNA 样品质控：使用NanoDrop ND-1000评估RNA量和质量，RNA完整性通过标准变性凝胶电泳进行评估；③RNA标记：根据Arraystar Super RNA Labeling(Arraystar, Inc.)试剂盒操作步骤，每个样本的总RNA采用随机引物扩增、反转录为荧光标记的cRNA；④芯片杂交：荧光标记的cRNAs在Arraystar Mouse circRNA Array(6×7 K, Arraystar)上杂交，随后在Agilent Hybridization Oven上65 ℃孵育17 h；⑤芯片扫描：洗片后，在 Axon GenePix 4000B扫描仪上扫描。

5. circRNA芯片数据采集与分析流程：①原始数据提取：芯片扫描图片导入GenePix Pro 6.0 (Axon)软件并读值，得到原始数据；②circRNA表达谱：用R软件包对数据进行归一化及后续数据处理；③差异表达的circRNA：两组样本间差异表达的circRNA通过Fold Change和P-value进行筛选。P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、肺组织差异表达上调的circRNAs

常氧组比较，HPH模型组肺组织中表达显著上调的且有统计学差异的circRNAs共有23个(P<0.01，P<0.05)，见表1。

表1 HPH模型组比常氧组表达显著上调的circRNAs(n=3)

二、肺组织差异表达下调的circRNAs

与常氧组比较，HPH模型组小鼠肺组织中表达显著下调的且有统计学差异的circRNAs共有41个(P<0.01，P<0.05)，见表2。

表2 HPH模型组比常氧组表达显著下调的circRNAs(n=3)

讨 论

circRNA是一类特殊的非编码RNA分子，是RNA领域中一个最新的研究热点。目前研究发现，circRNA有下列主要特征[3]：①circRNA由特殊的可变剪切产生，大量存在于真核细胞的细胞质[8]，但少部分内含子来源的circRNA则存在于细胞核内[9]；②具有一定的组织特异性、时序特异性和疾病特异性[8]；③广泛存在于人体细胞中，有时甚至超过它们线性异构体的10倍之多[10-11]；④与传统的线型RNA(linear RNA，含5′和3′末端)不同，circRNA分子呈封闭环状结构，不被核酸外切酶RNase R降解，比线性RNA更稳定[11-13]；⑤具有高度保守性[10-11]，部分具有快速的进化性改变[9,14]；⑥大多数来源于外显子，少部分由内含子直接环化形成[14]；⑦circRNA分子富含miRNA应答元件(miRNA response element, MRE)，可充当竞争性内源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)，与miRNA结合，吸附miRNA，在细胞中起到miRNA海绵(miRNA sponge)的作用，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，上调靶基因的表达[4]；⑧大部分是ncRNA[10]。这些特征使得circRNA在研究疾病发生机制、干预靶点和生物学标志物等方面显示显著的优势。

目前，circRNA的命名尚未统一。由于研究者各自的研究角度不同而造成命名的不一致[3]。因此，亟需构建一个更恰当的、适用的和公认的circRNA命名体系。本实验采用circbase数据库进行circRNA命名。

通过与疾病关联的miRNA相互作用，circRNA在疾病中发挥着重要的调控作用，为阐明疾病的发生机制、干预靶点和新型的疾病临床诊断标志物等提供强有力的手段。研究表明， CDR1as有至少60个与miR-7相结合的保守结合位点，从而充当miR-7海绵，有效影响miR-7靶基因活性[4-5]。CDR1as和miR-7在发育的中脑区域具有共同高表达的特点，在斑马鱼胚胎中，CDR1as的过表达造成中脑体积减少，且中脑体积的减少可通过注射miR-7前体得以部分恢复，这表明CDR1as的生物学效应至少部分通过其与miR-7相互作用而产生[4]。CDR1as是miR-7的环状抑制剂，对miR-7起负调控作用，可通过调控miR-7以影响肿瘤的产生[15]，发挥天然miRNA海绵功能[16]。此外， CDR1as亦可能与帕金森病有关[6]，Lukiw等[17]发现在ciRS-7(也被称为CDR1as)的海绵功能缺失时，miR-7表达上调，极有可能下调阿尔茨海默病相关靶点蛋白表达，如泛素化蛋白连接酶A[18-19]。睾丸特异性基因Sry 的circRNA具有16个miR-138的靶位点，可与miR-138相互作用，充当miR-138海绵[4]。circRNA cANRIL是基因INK4/ARF的反义转录物[20]，可通过有差异的PcG募集来抑制INK4/ARF表达，从而参与动脉粥样硬化发生的调控机制[7]。

本研究发现，与常氧组比较，HPH模型组肺组织中表达显著上调或下调的circRNAs分别有23个和41个，提示circRNA可能调控HPH发生发展。上述差异表达的circRNAs还需要进一步的实验加以验证，而相关的作用机制也将要通过circRNA/miRNA交互作用的研究来阐明。具体而言，借助LOF/GOF操作，下调或上调细胞circRNA表达，观察小鼠HPH特征变化，明确circRNA在HPH中的功能；观察circRNA吸附特定miRNA从而影响mRNA表达，circRNA芯片与mRNA表达谱芯片联合分析，研究circRNA、miRNA和mRNA三者关系，探明miRNA海绵机制；RIP或ChRIP证明circRNA、miRNA和Ago2蛋白相结合，深度阐明circRNA调节HPH的机制；用临床标本验证circRNA表达变化，以确定HPH生物学标志物。上述有待开展的研究将为阐明HPH的发生发展机制、明确干预靶点和确定临床诊断标志物提供科学依据。

1 McLaughlin VV, Archer SL, Badesch DB, et al. ACCF/AHA 2009 expert consensus document on pulmonary hypertension a report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on Expert Consensus Documents and the American Heart Association developed in collaboration with the American College of Chest Physicians; American Thoracic Society, Inc.; and the Pulmonary Hypertension Association[J]. J Am Coll Cardiol, 2009, 53(17): 1573-1619.

2 夏世金, 吴俊珍, 胡明冬. 低氧致炎与低氧性肺动脉高压[J/CD]. 中华肺部疾病杂志：电子版, 2014, 7(5): 563-565.

3 夏世金, 高文, 胡明冬, 等. 环状RNA的研究现状及展望[J/CD]. 中华肺部疾病杂志：电子版, 2014, 7(6): 670-673.

4 Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH, et al. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges [J]. Nature, 2013, 495(7441): 384-388.

5 Memczak S, Jens M, Elefsinioti A, et al. Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency[J]. Nature, 2013, 495(7441): 333-338.

6 Ghosal S, Das S, Sen R, et al. Circ2Traits: a comprehensive database for circular RNA potentially associated with disease and traits [J]. Front Genet, 2013, 4: 283.

7 Burd CE, Jeck WR, Liu Y, et al. Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates with atherosclerosis risk [J]. PLoS Genet, 2010, 6(12): e1001233.

8 Cocquerelle C, Mascrez B, Hétuin D, et al. Mis-splicing yields circular RNA molecules [J]. FASEB J, 1993, 7(1): 155-160.

9 Zhang XO, Wang HB, Zhang Y, et al. Complementary sequence-mediated exon circularization[J]. Cell, 2014, 159(1): 134-147.

10 Salzman J, Gawad C, Wang PL, et al. Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types[J]. PLoS One, 2012, 7(2): e30733.

11 Jeck WR, Sorrentino JA, Wang K, et al. Circular RNAs are abundant, conserved, and associated with ALU repeats [J]. RNA, 2013, 19(2): 141-157.

12 Suzuki H, Zuo Y, Wang J, et al. Characterization of RNase R-digested cellular RNA source that consists of lariat and circular RNAs from pre-mRNA splicing[J]. Nucleic Acids Res, 2006, 34(8): e63.

13 Suzuki H, Tsukahara T. A view of pre-mRNA splicing from RNase R resistant RNAs[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(6): 9331-9342.

14 Zhang Y, Zhang XO, Chen T, et al. Circular intronic long noncoding RNAs[J]. Mol Cell, 2013, 51(6): 792-806.

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16 Hentze MW, Preiss T. Circular RNAs: splicing's enigma variations [J]. EMBO J, 2013, 32(7): 923-925.

17 Lukim WJ. Circular RNA (circRNA) in Alzheimer's disease (AD)[J]. Front Genet, 2013, 4: 307.

18 Bingol B, Sheng M. Deconstruction for reconstruction: the role of proteolysis in neural plasticity and disease [J]. Neuron, 2011, 69(1): 22-32.

19 Lonskaya I, Shekoyan AR, Hebron ML, et al. Diminished parkin solubility and co-localization with intraneuronal amyloid-beta are associated with autophagic defects in Alzheimer′s disease[J]. J Alzheimers Dis, 2013, 33(1): 231-247.

20 Salzman J, Chen RE, Olsen MN, et al. Cell-type specific features of circular RNA expression[J]. PLoS Genet, 2013, 9(9): e1003777.

(本文编辑：王亚南)

夏世金，邰先桃，李 炳，等. 低氧性肺动脉高压小鼠肺的环状RNA表达谱研究[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2015， 8(1)： 40-44.

·医学动态·

监测肿瘤状态的特殊基因

近日，来自Mount Sinai Medical Center的研究人员通过研究发现两种癌症药物可以开启特殊基因的表达，而这种特殊基因则可以告知肿瘤细胞使其处于休眠状态。

当名为NR2F1的基因开启后其就会重编程肿瘤细胞使其处于休眠状态；而当该基因的表达关闭后肿瘤细胞就会开始分裂并且发生异常生长，从而潜在地使休眠中的细胞迅速生长成为肿瘤，并且发生全身性的转移。研究者表示，将抗癌药物氮杂胞苷和类维生素A进行结合就可以明显增加肿瘤细胞中活性NR2F1的水平。

NR2F1作为肿瘤细胞生长的主要调节基因，其影响着决定细胞是否处于休眠的许多基因的表达；本文研究显示，基因NR2F1在人类胚胎干细胞中发挥着长期的控制作用，在干细胞中其可以指挥细胞停止生长并且变成对生命活动重要的细胞，而NR2F1的这种功能也使其对肿瘤细胞可以施加较长的控制效应，当癌细胞从原发性位点增殖扩散后NR2F1就会促进癌细胞保持休眠状态。

Study of circular RNA expression profile of lungs in the mice with hypoxia-induced pulmonary hypertension

XiaShijin1,TaiXiantao2,LiBing3,SuJinyan2,DiHua2,LiuLumei1,WanWenbin4,HuMingdong5(1ShanghaiInstituteofGeriatrics,HuadongHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China；2SchoolofAcupuncture,MassageandRehabilitation,YunnanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Kunming650500,China；3CentralLaboratory,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201508,China；4DepartmentofNeurology,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China；5DepartmentofRespiratoryDiseases,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

HuMingdong,Email：huhanshandd@aliyun.comandTaiXiantao,Email：taixiantao@163.com

Objective To use mouse circRNA microarray to screen the differential expression of circRNA of lungs in the mice with hypoxia-induced pulmonary hypertension(HPH) and to study of circRNA expression profile in order to offer the research approach for HPH mechanism. Methods 20 healthy male C57BL/6 mice (weighing 17-20 g) were randomly divided into HPH model group and normoxic group, 10 mice each group. The mice of the HPH model group were exposed to normobaric hypoxia [(10±0.5)%O2environment)] in a ventilated hypoxic cabin for 21 days, whereas age-matched and weight-matched normoxic mice were maintained in a virus-free room with normoxic environment. The mice were sacrificed and the lung tissue was obtained from the HPH mice model group which was successfully replicated by measuring right ventricular pressure and index of right ventricular hypertrophy. The circRNA expression profiles of lung tissue in the two groups were detected by using the mouse circRNA microarray. The differential expression of circRNAs of lungs between the two groups were clarified via comparison and analysis of the circRNA expression profiles. Results Compared with the normoxic group, 23 up-regulated circRNAs and 41 down-regulated circRNAs were found in lung tissues of the HPH model group (P<0.01,P<0.05). Conclusions circRNA microarray can be used for screening the differential circRNA expression of HPH, and circRNA may be involved the regulatory mechanisms underlying HPH.

Circular RNA; Hypoxia-induced pulmonary hypertension; Mouse; Lung; Microarray; Non-coding RNA; Alternative splicing; microRNA

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.01.009

国家自然科学基金(81270115，81460748)

200040 上海，复旦大学附属华东医院上海市老年医学研究所1650500 昆明，云南中医学院针灸推拿康复学院2201508 上海，复旦大学附属金山医院中心实验室3200032 上海，复旦大学附属中山医院神经内科4400037 重庆，第三军医大学新桥医院呼吸内科5

胡明冬，Email：huhanshandd@aliyun.com 邰先桃，Email: taixiantao@163.com

R563

A

2015-01-13)