颜文杰 孙文逵,2 李 培,2 苏 欣,2 施 毅,2

·论著·

三种不同方法转染THP-1巨噬细胞效果比较

颜文杰1孙文逵1,2李 培1,2苏 欣1,2施 毅1,2

目的探讨通过腺病毒，慢病毒，脂质体2000三种方法转染THP-1巨噬细胞的最佳方法。方法采用腺病毒，慢病毒，脂质体2000三种方法分别转染THP-1巨噬细胞，并用荧光显微镜观察细胞转染荧光表达情况，流式细胞仪检测THP-1细胞转染效率，台盼蓝染色检测细胞病死率。结果腺病毒对THP-1巨噬细胞转染效率可在对细胞损伤较小的情况下达较高水平，但可能对细胞免疫状态影响大。MOI=200时，转染效率较低，仅为(29.81±2.50)%，细胞病死率为(5.17±0.44)%；MOI=800，转染效率最高，EGFP阳性率可达(86.49±6.11)%,细胞病死率为(8.80±0.54)%；MOI 升至1200后，EGFP阳性率为(77.88±5.77)%， 细胞病死率上升明显(14.50±0.77)%(P<0.05)；慢病毒转染效率高及细胞毒性较腺病毒低，但因其病毒产量低，实验消耗病毒量大，因而影响其应用。当MOI=10时， EGFP阳性率仅为(28.09±1.67)%, 细胞病死率为(4.74±0.31)%；MOI=60时，转染率最高，EGFP阳性率为(91.96±1.66)%，细胞病死率升至(7.25±0.50)%，此时病死率才有统计学意义(P<0.05)。脂质体2000对THP-1巨噬细胞毒性较大，细胞死亡率高，转染效率极低，不适合转染。结论腺病毒与慢病毒转染THP-1巨噬细胞各存在一定优劣，在实验中需酌情选择，脂质体2000不适宜转染THP-1巨噬细胞。

THP-1巨噬细胞； 腺病毒； 慢病毒； 细胞转染

THP-1悬浮细胞为人白血病单核细胞系，属于血液系统肿瘤细胞范畴，佛波酯(PMA)能够诱导THP-1贴壁，并在48 h左右分化成熟，生成THP-1巨噬细胞[1-3]。THP-1巨噬细胞为终末细胞，丧失增殖分化能力，在光镜下可见其紧密贴壁，呈现梭形或者多形性，并有伪足形成，电镜下则可见胞浆内线粒体及溶酶体的数量较之THP-1悬浮细胞明显增加。此外其表面的分子标志物如CD206等以及抗凋亡蛋白MCl-1的含量均与人单核细胞来源巨噬细胞(monocyte-derived macrophages，MDM)近似。THP-1巨噬细胞具有模式识别受体，能够识别并吞噬病原体，分泌炎症相关细胞因子，并启动后续的炎症反应过程[4]。国外已有采用THP-1巨噬细胞作为巨噬细胞感染模型的报道[5-7]。

细胞转染是指利用物理化学及生物介导等手段将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。常见的转染技术包括病毒转染，脂质体转染及显微注射、电穿孔转染等方式。其中病毒转染具有操作简便，转染效率高，细胞病死率低的优势，但是构建载体步骤复杂，成本高昂。脂质体转染成本低廉，但是细胞毒性大，对细胞的正常生理活性影响严重。而显微注射、电穿孔等物理转染方法因设备昂贵，对人员技术操作要求高等因素，限制了其在实践中的应用。

本实验拟通过腺病毒，慢病毒，脂质体2000三种方法分别转染THP-1巨噬细胞，探讨转染THP-1巨噬细胞的最佳方法，为THP-1巨噬细胞相关感染实验提供基础。

材料和方法

一、主要材料与试剂

人THP-1细胞来源于南京军区南京总医院呼吸内科实验室；胰酶：碧云天公司；1640细胞培养基(维森特公司)；OPTI培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(维森特公司);佛波酯(碧云天公司); 无内毒素质粒提取试剂盒(OMEGA公司)；脂质体 2000(Invitrogen公司)；人E5型腺病毒及慢病毒(购自上海锐赛公司)。

二、细胞培养

THP-1悬浮细胞采用90%1640细胞培养基(维森特)+10%胎牛血清(维森特)+1%青霉素和链霉素(Gibco BRL)配置的1640完全培养液。设定细胞箱培养环境为饱和湿度，37 ℃，5% CO2浓度。根据THP-1细胞生长速度采用半定量换液或离心换液每1～2 d换液一次。在THP-1细胞经由佛波酯诱导贴壁后，细胞培养液及培养环境与THP-1悬浮细胞相同，换液方式采取每日弃去部分旧培养液，加入新的培养液。

三、实验方法

1. PMA诱导THP-1悬浮细胞贴壁: 将PMA 4.5 μl加至45 ml 1640培养液中，配置为母液，保存在4 ℃冰箱中，并于1月内使用完毕。在使用时，依次将纯1640培养基，PMA母液， THP-1悬浮细胞加入培养板中，吹打混匀，最终使得PMA母液占总体积的1/10。24 h后观察贴壁及细胞汇合度，如细胞贴壁不佳，丢弃培养板，如细胞贴壁良好，更换1640纯培养基为1640无抗生素完全培养基，再培养24～48 h。

2. 脂质体2000介导质粒转染THP-1巨噬细胞： 将1×106个数量的细胞接种6孔板中，PMA诱导48 h，贴壁成功。将转染培养基、质粒，脂质体2000等自冰箱取出，复苏至室温。稀释4.0 μg质粒DNA至250 μl OPTI培养基中混匀；稀释10 μl脂质体至250 μl OPTI培养基中混匀，静置5 min，上述配置液体混合25 min，均匀加入已处理贴壁及更换无抗生素培养基的目标细胞孔中。6 h吸出转染液，PBS轻柔吹洗1遍，更换为1640完全培养液。24～48 h后观察荧光。

3.慢病毒及腺病毒转染THP-1巨噬细胞： THP-1细胞计数后，PMA诱导铺板。选择24孔板铺板，每个孔细胞量为1.5×105/孔，24 h后换液，再培养24 h，并于镜下观察铺板成功后，将培养液吸出，PBS清洗2遍，将配好的不同感染复数(multiplicity of infection, MOI)的不含血清的1640/病毒(腺病毒MOI分别为200,500,800,1200；慢病毒MOI分别为10,20,40,60)混合液均匀加入孔中。15 h后换液，更换为完全1640培养基。48 h荧光显微镜观察荧光。每组实验重复3次。

4.流式细胞仪检测细胞转染效率： 在慢病毒及腺病毒转染72 h，脂质体2000转染36 h后，将转染后THP-1巨噬细胞采用PBS清洗2遍，胰酶消化细胞2 min，1640完全培养基终止消化后，以离心半径8 cm，1200 r/min，离心5 min，弃除上清液，再次PBS重悬细胞。流式细胞仪检测上述细胞悬液强化绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)表达情况。

5. 台盼蓝染色检测细胞病死率：采用双蒸水配置浓度4%台盼蓝，并于冰箱4 ℃保存。使用前，首先将母液用PBS稀释至0.4%，并复苏至室温。将转染后的THP-1巨噬细胞采用PBS清洗2遍，胰酶消化细胞1.5 min，1640完全培养基中止消化，以离心半径8 cm，1200 r/min，离心5 min，弃除上清液后，PBS重悬细胞。将细胞悬液与前面配置的0.4%台盼蓝溶液以9︰1混匀，最终使得混合液台盼蓝终浓度为0.04%，吸取10 μl染色细胞悬液至细胞计数板，并在3 min内，光镜下观察，计数蓝色染色的死细胞，及呈无色透明状的活细胞。细胞病死率(%)=染色细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100%。每组实验重复4次

四、统计学方法

结 果

一、腺病毒转染THP-1巨噬细胞分析

光镜下，可见腺病毒转染后各组细胞形态、透光度良好，未见明显大片细胞死亡，及细胞碎片形成。荧光显微镜及流式细胞仪检测可见随着腺病毒转染的MOI浓度增加，EGFP阳性细胞比例逐渐升高，转染效率不断增加，但至MOI=1200时，则略有所下降，见图1、2。

图1 荧光显微镜检测不同MOI下腺病毒转染THP-1巨噬细胞比较

MOI为200时，转染效率较低，仅为(29.81±2.50)%，细胞病死率为(5.17±0.44)%；当MOI在800时，此时转染效率最高，EGFP阳性率可达(86.49±6.11)%，细胞病死率为(8.80±0.54)%；而当MOI提高至1200后，转染效率则有所下降，EGFP阳性率为(77.88±5.77)%，此时细胞病死率则上升明显，升至(14.50±0.77)%。组间差别具有统计学意义(P<0.05),见表1。

二、慢病毒转染THP-1巨噬细胞分析

光镜下，可见慢病毒转染后各组细胞同样保持了良好的形态、透光度，视野内无未见明显大片细胞死亡。荧光显微镜下可见随着慢病毒转染的MOI浓度增加，EGFP阳性细胞比例逐渐升高，转染效率不断增加，至MOI=60时，转染效率达到最高，此结果与流式细胞仪数值一致, 见图3、4。

图3 荧光显微镜检测不同MOI下慢病毒转染THP-1巨噬细胞效率比较

图2 流式细胞仪检测腺病毒转染后各组细胞EGFP阳性率

图4 流式细胞仪检测慢病毒转染后各组细胞EGFP阳性率

当MOI在10时，此时EGFP阳性率仅为(28.09±1.67)%，细胞病死率为(4.74±0.31)%；而当MOI提高至40后，EGFP阳性率上升为(73.81±2.76)%，细胞病死率为(5.77±0.54)%；当MOI=60时，转染效率达到最高，EGFP阳性率为(91.96±1.66)%，细胞病死率则升至(7.25±0.50)%。提示随着慢病毒MOI浓度提高，THP-1巨噬细胞转染效率逐渐上升，但同时细胞病死率上升趋势不明显，组间无统计学差异，直到MOI=60时，病死率差别才出现统计学意义(P<0.05)，见表1。

三、脂质体2000转染THP-1巨噬细胞分析

脂质体2000对THP-1巨噬细胞杀伤明显，光镜下见细胞变形，崩解，碎裂，大片细胞死亡，台盼蓝染色见细胞病死率在(47.87±4.67)%左右。且荧光镜下及流式细胞仪均未见明显荧光表达[流式细胞仪检测EGFP阳性率为(2.39±0.21)%]，见图5、6。

图5 荧光显微镜检测脂质体2000转染THP-1巨噬细胞效率

图6 流式细胞仪检测脂质体2000转染后细胞EGFP阳性率

讨 论

腺病毒属于双链DNA病毒，作为基因表达的载体，它具有诸多优点，它能够以较高的效率转染入细胞(转染效率通常在70%以上)，它能感染增殖及非增殖期的细胞，且因病毒基因组游离于核内，不整合至细胞基因链中，病毒突变致癌风险小。目前新型的腺病毒载体的抗原性及细胞毒性已较野生株明显降低，因而可以将其对细胞的影响减至最低，它所能够插入的外源性基因片段也较长(可达8 kb)，此外它的构建、制备成本低，价格低廉，且所获得的病毒液滴度高(一般在1011～1012 pfu/ml)，因此腺病毒载体在细胞试验及基因治疗中被广泛应用。但是腺病毒载体同时具有一定的缺点，它的抗原性较慢病毒载体免疫源性高，对细胞的免疫状态影响大。它的细胞感染能力较其他病毒载体弱，所消耗病毒量大，且病毒生产的周期长，因此限制了其在实践中的应用[8]。在本实验中，腺病毒转染效率最高达到了(84.69±6.11)%，体现了极高的转染效率。但是与之对应的是所需的病毒浓度明显增高。为达到最佳转染效率，所需的腺病毒MOI为800，这与其他文献报道结果相一致[9-11]。这种现象可能与吞噬细胞的免疫特性相关。巨噬细胞具有吞噬及溶解杀灭病原体的功能，人工改造的腺病毒载体虽然免疫源性较野毒株弱，但依然能够引起吞噬，溶解、杀灭及炎症募集等一系列免疫反应[12-13]。有文献报告在腺病毒感染过程中，转录因子PU.1的表达上调，能够促进免疫细胞的非特异性吞噬的作用[14]，并能够抑制腺病毒进入细胞核内，并促进其在溶酶体内溶解，从而显著抑制腺病毒载体表达，起到免疫清除的作用[15]。这从一方面也解释了THP-1细胞转染需要如此巨大病毒量的原因。

表1 腺病毒，慢病毒及脂质体对THP-1细胞转染效率及病死率对比

注：三种转染方法比较，P<0.05

慢病毒属于RNA病毒，慢病毒载体与腺病毒载体相比较具有一定的优点。它的转染效率较腺病毒高(可达85%～100%)。它能够将基因片段整合至宿主细胞的染色体中，因而能够稳定、高水平表达，并能够获得稳定转录株及转基因动物。它具有较低的免疫原性，对细胞免疫状态的影响小。它的转染能力强，所消耗的病毒量小，特别是对于腺病毒难以转染的干细胞、原代细胞，慢病毒往往能够以较高的效率转录。因此慢病毒载体在基础实验及基因治疗中均有着广阔的前景[16-17]。但是慢病毒载体也存在一定的缺点，它可插入的外源性片段较小，一般不能超过2 kb，它的价格昂贵，生产工艺复杂，生产条件一般的实验室难于具备。且一般公司能够生产的最终滴度一般为109 TU/ml数量级，因而限制了其在细胞实验中的应用。考虑本实验需要的病毒量较大，以六孔板细胞铺板量为106计算，在MOI=60的情况下，一个生产周期仅仅能够提供数十个孔所需的病毒量。而且THP-1诱导的巨噬细胞丧失了增殖活性，不能采用慢病毒稳定转录筛选THP-1巨噬细胞系。因此慢病毒也难以作为THP-1细胞表达载体的首选。

脂质体能够与细胞膜发生融合，进而产生内吞作用，外源性DNA质粒能够被脂质体包裹后，形成带正电荷的复合体，并被细胞膜吸附及吞噬，进入细胞核内表达。脂质体转染试剂因其廉价，操作简便而在细胞实验中广泛应用。但是脂质体转染试剂转染效率偏低，对部分细胞极其不敏感，且其具有明显的细胞毒性。它能够影响细胞的生理活性，干涉细胞的生理活动，影响细胞通路的正常进行，例如脂质体转染会影响细胞的生理状态及免疫情况。它能够参与调节蛋白激酶C的通路，能够显著抑制ATP酶的活性，如与线粒体膜发生作用。此外，利用脂质体转染小干扰RNA有可能造成脱靶效应甚至导致细胞的大量死亡。本实验中，THP-1巨噬细胞利用脂质体转染的效率极其低下，基本无目标荧光蛋白表达，且其细胞毒性强，病死率极高，因此不考虑采用脂质体转染THP-1巨噬细胞。

本实验发现，脂质体2000对THP-1巨噬细胞毒性极大，细胞病死率可高达(47.87±4.67)%，转染效率极低，仅为(2.39±0.21)%，不适合THP-1巨噬细胞转染。腺病毒细胞毒性较低的情况下具有极高的转染效率(86.49±6.11)%，但是转染最佳MOI明显增高，因而对细胞免疫状态影响大，有影响后续实验的风险，在载体选择及实验设计时要充分考虑。慢病毒相比腺病毒，其转染效率进一步提升，最高转染效率可达(91.96±1.66)%，且同时病死率仅为(7.25±0.50)%，具有明显的优越性。但因其病毒产量低，实验消耗病毒量大，成本偏高因而影响其应用。

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(本文编辑：王亚南)

颜文杰，孙文逵，李 培，等. 三种不同方法转染THP-1巨噬细胞效果比较[J/CD]. 中华肺部疾病杂志： 电子版， 2015， 8(1)： 7-12.

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Comparison of transfection of THP-1 macrophage by three different methods

YanWenjie1,SunWenkui1,2,LiPei1,2,SuXin1,2,ShiYi1,2(DepartmentofRespiratoryMedicine,1NanjingClinicalCollege,theSecondMilitaryMedicalUniversityofPLA,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryAreaCommandofPLA,Nanjing210002,China；2NanjingUniversityClinicalSchoolofMedicine,Nanjing21000,China)

ShiYi,Email:shiyi56@126.com

Objective Three methods were used for transfection of THP-1 macrophage, which included adenovirus, lentivirus and liposome 2000. To research the optimal method for the transfection of THP-1 macrophage. Methods Adenovirus, lentivirus and liposome 2000 were used for transfection of THP-1 macrophage, fluorescence expression conditions of cell transfection were observed with a fluorescence microscope, the transfection efficiency of THP-1 cell was detected with a flow cytometry, and cell mortality rate was detected by trypan blue staining method. Results Adenovirus exhibited high transfection efficiency of THP-1 macrophage, and low cellular damage. But it may have strong effects on cellular immune conditions. MOI=200, transfection efficiency is lower(29.81±2.50)%, cell mortality is (5.17±0.44)%. MOI=800, transfection efficiency with the highest rate, EGFP positive rate is(86.49±6.11)%, cell mortality is(8.80±0.54)%. When MOI=1200, EGFP positive rate is(77.88±5.77)%, cell mortality increased significantly(14.50±0.77)%(P<0.05). Lentivirus with higher transfection efficiency and lower cellular damage than adenovirus, but low output and high consumption make it can′t be applied widely. When MOI=10, EGFP positive rate is (28.09±1.67)%, cell mortality is(4.74±0.31)%.MOI=60, transfection efficiency with the highest rate, EGFP positive rate is (91.96±1.66)%, cell mortality is(7.25±0.50)%,P<0.05. Lipid some 2000 had strong cytotoxic effects on THP-1 macrophage, cell mortality rate was high, and transfection efficiency was low, so the method is not suitable for transfection.Conclusions Adenovirus and lentivirus have their special advantages and disadvantages for transfection of THP-1 macrophage, selection of transfection method should according to special conditions of researches, generally, liposome 2000 is not suitable for transfection of THP-1 macrophage.

THP-1 macrophage； Adenovirus； Lentivirus； Transfection

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2015.01.003

国家自然科学基金(81270064)

210002 南京，中国人民解放军第二军医大学南京临床学院 南京军区南京总医院呼吸与危重症学科1210002 南京，南京大学医学院临床学院2

施 毅，Email: shiyi56@126.com

R563

A

2014-12-19)