张晓芬，冶贵生，马玉花，贺晓龙，康 明，张 爽，韩志辉，贾跃宁，张洪波

（青海大学农牧学院，青海西宁810016）

藏羊（Tibetan sheep）是青藏高原优势畜种之一，藏羊有较强的抗病力［1］，这种特性与其免疫基因密切相关。主要组织相容性复合体（major histocompatility complex，MHC）是脊椎动物中与免疫相关的一个高度紧密连锁的基因群，控制着动物机体产生免疫应答的能力。绵羊的MHC又称为绵羊淋巴细胞表面抗原（ovine lymphocyte antigen，OLA），分为Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类，具有提呈外源性抗原物质给辅助T 淋巴细胞，触发免疫应答的作用［2］。OLAⅡ类分子上只有OLADR和OLA－DQ 基因能够在蛋白质水平上表达，DR亚区和DQ 亚区的DRB和DQB两个基因的第2外显子编码抗原结合区，是组成OLAⅡ类分子功能最重要的部分［3］。OLAⅡ分子与绵羊的寄生虫病、腐蹄病等疾病抗性相关，申红等［4］采用PCR－RFLP方法研究了多浪羊MHC－DQB1基因外显子2多态性，发现MvaⅠD可能为多浪羊包虫病的抗性基因。杜迎春等［5］研究表明中国美利奴羊DQB1抗性单倍型绵羊对细粒棘球绦虫的抵抗力显著高于非抗性绵羊。刘秀等［6］检测了216 只表型正常和患腐蹄病藏绵羊OLADQA2基因第2外显子的多态性，发现在未患腐蹄病的羊只中，等位基因DQA2＊F和＊L频率较高，推断等位基因DQA2＊F和＊L具有较强的抵抗腐蹄病的遗传潜力。目前关于藏羊OLAⅡ类分子的报道较少，仅见于藏羊OLA－DQA 和OLA－DRB基因的研究，未见藏羊DQB1基因编码蛋白结构预测方面的报道。因此，本研究在前期获得藏羊DQB1基因序列的基础之上，对藏羊DQB1基因编码蛋白的结构进行预测，旨在为青海藏羊DQB1基因抗病性的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

藏羊DQB1基因序列来源于前期研究工作［7］。利用DNA Star生物软件中的Ⅰ－Tasser、SignalP4.1、PredictProtein和TMHMM 在线服务器。

1.2 方法

采用DNA Star软件中Garnier J等［8－10］的方法预测藏羊DQB1蛋白的α螺旋、β折叠、β转角、无规则卷曲和柔韧性等二级结构。采用DNA Star软件中Kyte J等［11］的方法预测DQB1蛋白的疏水性。采用SignalP4.1在线服务器预测DQB1蛋白的信号肽。采用TMHMM 在线服务器预测DQB1蛋白的跨膜螺旋区。采用PredictProtein在线服务器预测DQB1蛋白的修饰位点。采用Ⅰ－Tasser在线服务器预测DQB1蛋白的三级结构。

2 结果

2.1 DQB1蛋白二级结构预测

Garnier等方法预测结果表明（图1），DQB1蛋白二级结构中α螺旋占0.383%；β折叠占62.8%，在整个肽段中分布较多也较均匀，主要区域为1－10、14－26、38－42、46－49、55－63、67－72、88－91、99－104、106－111、116－121、128－134、138－141、146－155、158－164、171－181、186－195、202－209、216－220、229－253、258－261 位 氨 基 酸；β转角占18%，主要区域为112－115、142－145、197－201、254－257位氨基酸；无规则卷曲占19.2%，主要区域为12－13、27－28、30－31、35－36、50－54、64－66、82－85、94－95、97－98、135－137、165－170、184－185、213－215、221－226位氨基酸。

Chou等方法预测结果表明（图1），DQB1蛋白二级结构中α螺旋占19.5%，分布区域为5－8、65－72、88－92、98－110、138－144、216－222、227－233位氨基酸；β折叠占45.6%，分布较多，主要区域为13－25、40－48、53－63、79－83、115－117、120－133、145－154、158－164、171－181、186－194、201－208、238－252、257－261 位 氨 基 酸；β转角占29.1%，主要区域为1－4、9－12、27－30、32－39、49－52、73－76、84－87、94－97、111－114、134－137、155－158、165－168、182－185、197－200、209－212、223－226、234－237、253－256位氨基酸。

Karplus等方法预测结果表明（图1），DQB1蛋白柔韧性区域较丰富，主要分布区为10－12、26－38、50－55、66－68、73－77、83－90、94－98、107－108、125－131、133－139、153－160、165－172、176－185、196－201、210－216、222－231、233－236、254－258位氨基酸。

2.2 DQB1蛋白疏水性预测

Kyte－Doolittle 方 法 预 测 结 果 显 示（图2），DQB1蛋白具有一定的疏水性，主要分布区为1－28、42－47、144－153、175－179、186－194、214－216、231－251位氨基酸。

图1 DQB1蛋白二级结构Fig.1 Second structure of DQB1protein

图2 DQB1蛋白疏水性Fig.2 Hydrophobicity plot of DQB1protein

2.3 DQB1蛋白信号肽预测

应用Signal IP在线软件对DQB1蛋白进行信号肽预测，结果表明（图3），DQB1蛋白具有信号肽。

2.4 DQB1蛋白跨膜螺旋区预测

应用TMHMM 在线软件对DQB1蛋白进行跨膜螺旋区的预测，结果表明（图4），DQB1 蛋白有1个跨膜螺旋区，位于肽链的232－251位氨基酸。

2.5 DQB1蛋白修饰位点预测

应用PredictProtein在线软件对DQB1蛋白进行修饰位点预测，结果表明该蛋白含有1个N－糖基化位点，为51－54位的NGTE；5个蛋白激酶C 磷酸化位点，分别为53－55位的TER、95－97位的SQK、171－173位的TAR、204－206位的TCR、255－257位的SQK；4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，分别为35－38 位 的SPQD、95－98 位 的SQKD、136－139 位 的SRTE、150－153位的SVTD；1个酪氨酸激酶磷酸化位点，为71－79位的RFDSDWGEY；2个N－豆蔻酰基化位点，分别为12－17 位的GLWTAA、86－91 位的GQRQAE；1 个细胞附着序列，为199－201 位的RGD；1个免疫球蛋白和主要组织相容性复合体蛋白，为203－209位的YTCRVEH。

2.6 DQB1蛋白三级结构预测

应用Ⅰ－Tasser在线软件对DQB 蛋白进行三级结构预测后得到5种模型（图5），这5种模型的C－score值均在［－5，2］的置信区间内（模型1：Cscore＝－1.04，模型2：C－score＝－1.78，模型3：Cscore＝－2.54，模型4：C－score＝－2.44，模型5：Cscore＝－3.30），主要以α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成。模型1相对于其他4个模型而言，C－score值最大，可信度较高。

图3 DQB1蛋白信号肽Fig.3 Signal peptide of DQB1protein

图4 DQB1蛋白跨膜螺旋区Fig.4 Transmenbrane helical area of DQB1protein

图5 DQB1蛋白三级结构Fig.5 Tertiary structure of DQB1protein

3 讨论

MHCⅡ类分子在免疫系统中发挥抗原提呈的作用，外源性抗原被抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）通过吞噬、受体介导的内吞或胞饮作用摄入胞内，与内体融合后被转运至溶酶体。MHCⅡ类分子在APC内质网腔中被合成，进入高尔基体中被修饰后，在内吞系统与外源性抗原相遇，进入溶酶体后结合抗原肽形成复合物，该复合物通过胞内转运或胞吐作用表达于APC表面，并被提呈给CD4＋T 细胞受体（T cell receptor，TCR）识别，使CD4＋T 细胞活化和增殖，触发细胞免疫反应［12］。DQB1基因作为MHCⅡ类分子的一种亚基，在免疫系统中发挥着重要的作用。本研究通过对藏羊DQB1蛋白进行信号肽预测，结果表明该蛋白具有信号肽，这说明该蛋白可能是在信号肽的引导下进入APC内质网腔，从而结合外源性抗原肽起到抗原提呈的作用。DQB1蛋白有一个跨膜螺旋区，位于肽链的232－251位氨基酸，由于DQB1蛋白需穿过APC膜的磷脂双层，跨膜区须由疏水性氨基酸组成，DQB1蛋白疏水性预测结果显示在231－251位有一个疏水区，这与跨膜螺旋预测结果相符。藏羊DQB1蛋白预测后有7种修饰位点，蛋白N－糖基化（（N－glycosylation）对于蛋白质的折叠、运输、定位起着重要作用［13］，推测DQB1蛋白进入APC内质网后经N－糖基化完成MHC多肽复合物的加工。DQB1蛋白除了有N－糖基化修饰外还是多种激酶的底物，蛋白激酶C（protein Kinase C，PKC）是一种重要的细胞内信号转导物质，对T 淋巴细胞的活化有着重要的调控作用［14］；酪蛋白激酶Ⅱ（casein kinaseⅡ）通过对底物的磷酸化在细胞增殖与分化、信号传导、细胞凋亡等方面起着重要的作用［15］；蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）是信号传递过程中的重要因子［16］，推测这3种激酶被激活后可能参与了DQB1蛋白在提呈抗原过程中的信号传递。N－豆蔻酰基化（N－myristoylation）能够调节蛋白与膜的可逆性结合，豆蔻酸与一些水溶性蛋白共价结合，使得这些水溶性蛋白被锚定在质膜的细胞质面成为膜蛋白［17］，推测DQB1蛋白可能经豆蔻化后定位于膜上，从而将抗原多肽复合物递呈给辅助T 淋巴细胞并活化CD4＋T细胞，最终触发免疫应答。

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