孟 凯，孙文静，柴同杰，刘建柱＊，马泽芳

（1.山东农业大学动物科技学院，山东泰安271018；2.青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109）

细菌的内毒素（endotoxin）是来自于革兰阴性细菌外膜上的脂多糖蛋白复合物（lipopolysaccharide－protein complex，LPS），在特定的环境中内毒素能够引起机体产生支气管炎症、发热及肺功能的下降［1－3］。许多研究已经证明，细菌内毒素可以引起畜禽呼吸道疾病的发病率上升，继而引发畜禽的支气管炎、肺炎、肺功能下降等［4－5］，如果长时间的暴露在高浓度的内毒素环境中，其工作人员患呼吸道及肺部疾病的概率要远远高于普通人群的患病率［6］。环境中的内毒素可以与尘埃等微粒结合，在空气中悬浮很长时间，并有增加积聚的可能性，可对动物机体和工作人员产生许多危害，如白细胞减少症、Shwartzman反应和休克等［7］，这些都说明了检测动物舍内气载内毒素的必要性和重要性。在细菌气溶胶中，虽然革兰阴性菌仅仅占了很小的比例，但大多数的革兰阴性菌为致病菌和条件致病菌。检测畜禽舍中气载革兰阴性菌浓度和组分对于评估动物舍环境质量具有重要意义。

近年来，国内外的学者已经对猪舍、牛舍、犊牛舍、兔舍舍内气载内毒素和革兰阴性菌的含量进行了检测与研究［8－9］，而对特种经济动物舍内微生物气溶胶的检测还非常少，特种经济动物的养殖环境问题应当更加受到重视。因为特种经济动物养殖业具有高投入、高产出和高风险的特点，一旦暴发传染病，其损失要比一般的畜禽养殖户大得多，所以对其环境中微生物气溶胶的含量和组成成分的分析显得非常重要。本试验通过对5个特种经济动物鹿舍内气载内毒素、气载革兰阴性菌和需氧菌浓度的检测来客观评估其对鹿舍环境的污染及对饲养员和动物体健康的危害，从而对鹿舍的环境状况作出客观评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 A 鹿场位于山东省泰安市郊，远离公路，饲养方式为半封闭圈养，主要养殖梅花鹿。总共饲养120头，鹿舍规格为200m×20m×3.5m。自然通风，每天清粪1次。采样时基本的气象条件为：温度25℃，湿度65%，风速1.5m／s。采样时间为2015年5月5日。

B鹿场位于山东省济宁市郊，远离公路，周围无居民区，无噪音源，饲养方式为半封闭圈养，主要养殖梅花鹿，总共饲养95 头，鹿舍规格为180 m×15m×3.5 m。自然通风，每天清粪一次。采样时基本的气象条件为：温度26℃，湿度62%，风速0.8 m／s。采样时间为2015年5月12日。

C鹿场位于山东省潍坊市郊，远离村庄，无噪音源，饲养方式为半封闭圈养，共养殖梅花鹿110头，鹿舍规格为200m×20m×3m。采用自然通风方式，每天清粪一次。采样时基本的气象条件为：温度23℃，湿度58%，风速1.2 m／s。采样时间为2015年5月18日。

D 鹿场位于山东省东营市郊，饲养方式为半封闭圈养，以养殖梅花鹿为主，共135头，鹿舍规格为220m×25 m×3.5 m。自然通风，每天清粪一次。采样时基本的气象条件为：温度235℃，湿度63%，风速2.3m／s。采样时间为2015年5月25日。

E鹿场位于山东省聊城市郊，远离村庄，饲养方式为半封闭圈养，共养殖梅花鹿86头，鹿舍规格为180m×15m×3m。自然通风，每天清粪一次。采样时基本气象条件为：温度28℃，湿度55%，风速1.5m／s。采样时间为2015年6月12日。

1.1.2 主要试剂和仪器 无热源内毒素检查用水，无热源的盐酸和氢氧化钠溶液，细菌内毒素检测无热源枪头均购自湛江博康海洋生物有限公司；LAL试剂（QLC－100Bio Whittaker，Walkersile，MD），国际标准的AGI－30 空气微生物收集器（All Glass Impinger，AGI－30），Andersen－6级撞击式空气微生物采样器，DH4000型电热恒温培养箱，天津泰斯特仪器有限公司；无菌超净工作台（AIR TECH），苏净集团安泰公司制造；微量移液器（GILSON），France公司；数显恒温水浴锅（HH－6），国华电器制造厂；全自动高压蒸汽消毒锅，酶标仪（TECAN），Austria公司产品。

1.2 方法

1.2.1 鹿舍环境空气内毒素的检测 鹿舍内空气中内毒素的含量通过国际标准的AGI－30液体冲击式收集器和LAL 试剂测得。将AGI－30 空气微生物收集器放在鹿舍中，每隔10 m 放置一个AGI－30空气微生物收集器，放置高度为80cm，采样介质为50 mL 内毒素检查用水（湛江博康海洋生物制品厂），采样时气流速度为12.5L／min，采样时间为30 min，每个鹿舍同时收集6个空气样品，样品收集在正常的工作时间进行，尽量不影响鹿群的正常生理活动。将采集到的气载内毒素样本立刻放在0℃～4℃的冰盒内保存，返回实验室后立即放在4℃的冰箱中保存。首先利用无热源的盐酸或氢氧化钠溶液调节样本的pH 至7～8之间。最后，根据采样时间和气流速度得出鹿舍环境气载内毒素的含量（EU／m3）。鹿舍内每m3空气中内毒素的计算公式为：

每m3空气中气载内毒素的含量＝（样本中内毒素的浓度×采样介质体积）／（AGI－30气流速度×采样时间）

1.2.2 鹿舍环境气载革兰阴性菌的检测 利用Andersen－6级收集器收集气载革兰阴性菌，采样介质为5%的绵羊血营养琼脂培养基，将收集器置于鹿舍内，每次采集6 个空气样品，每个收集器间隔10m，收集器放置高度为80cm，采样时气流速度为28.3L／min，驱动时间根据鹿舍内空气质量情况设置为5min～10min，保证6节平皿上都能采到菌，菌落数以30个～300个为宜。各点采样同时进行。采样结束后将培养皿置于恒温箱中37℃需氧培养24h～48h，记录各血琼脂平板上的需氧菌数。经Andersen校正表校正后，得到气载需氧菌含量（CFU／m3）。然后对气载需氧菌进行革兰染色和镜检，纯分离培养后，进行API－20E（Bio Merieux，Marcy－I’Etoile，France）试验进行鉴定，确定其含量（CFU／m3）。

1.2.3 鹿舍环境中气载真菌的检测 鹿舍内气载真菌的浓度通过Andersen－6 级空气微生物收集器进行检测，将收集器置于鹿舍中央，放置高度为80 cm，样品采集时的空气流速为28.3L／min，采样介质为沙保弱培养基，收集器的驱动时间为3 min～5min。采样结束后25℃条件下培养5d～7d进行菌落计数，每个平板上的菌落数以30个～300个为宜。最后，按照Andersen校正表校正后，获得鹿舍内气载真菌的浓度（CFU／m3）。

1.2.4 鹿舍内粪便和饲料样品的处理 在5个鹿舍内分别采集粪便和饲料样本，在鹿舍内的不同地方采集6个粪便样本和6个饲料样本，将采集到的粪便和饲料样本立即放在0℃～4℃保温箱中带回实验室。首先用无热源的检查用水分别将粪便和饲料样本进行连续10倍稀释，之后通过LAL 试验测定粪便和饲料中内毒素的含量；同时将一部分的粪便和饲料样本定量涂于5%绵羊血培养基上，每个稀释梯度涂3个平板，根据以上方法确定粪便和饲料样本中革兰阴性菌的含量。

1.2.5 数据分析 鹿场舍内环境气载内毒素、细菌浓度和真菌浓度采用了中间值表示，用最大值与最小值反映数值的波动范围，减少数据的误差。

2 结果

2.1 鹿场环境舍内气载内毒素的浓度

5个鹿场舍内气载内毒素的浓度介于0.085×103EU／m3～1.380×103EU／m3之间。5个鹿场舍内气载内毒素的浓度均未超出能引起肺炎的标准（2 000EU／m3），但都部分超出了对人体无影响的标准（100EU／m3）［10］。虽然目前还没有针对特种经济动物鹿舍内气载内毒素的标准范围，但是也不能忽视其对舍内环境的影响（表1）。

表1 鹿舍内气载内毒素浓度Table 1 Concentrations of airborne endotoxin in deer houses

2.2 鹿场环境舍内气载需氧菌、气载革兰阴性菌和气载真菌的浓度

5 个鹿场舍内的气载需氧菌浓度介于0.45×104CFU／m3～5.24×104CFU／m3之间；气载革兰阴性菌的浓度介于0.01×103CFU／m3～1.58×103CFU／m3之间；气载真菌浓度在0.12×103CFU／m3～2.08×103CFU／m3之间（表2）。其中，气载内毒素的浓度与气载需氧菌的浓度存在弱的正相关（r＝0.26），气载内毒素的浓度依赖于气载需氧菌的浓度通过下列回归方程表示：y＝0.0062x＋399.99（y：气载内毒素浓度lgEU／m3；x：气载需氧菌浓度lgCFU／m3）。气载内毒素的浓度与气载革兰阴性菌的浓度也存在弱的正相关（r＝0.22），气载内毒素的浓度依赖于气载革兰阴性菌的浓度通过下列回归方程表示：y＝－0.2297x＋785.43（y：气载内毒素浓度lgEU／m3；x：气载革兰阴性菌浓度lgCFU／m3）。因此，不能通过气载需氧菌和气载革兰阴性菌总数来估计气载内毒素的含量。

2.3 鹿场舍内粪便和饲料中革兰阴性菌浓度和内毒素浓度

5 个鹿场舍内粪便中革兰阴性菌的浓度为0.87×106CFU／g～7.85×106CFU／g；粪便中内毒素的浓度为0.52×105EU／g～6.48×105EU／g；饲料中革兰阴性菌的浓度为0.27×105CFU／g～3.60×105CFU／g；饲料中内毒素的浓度为1.58×103EU／g～6.25×103EU／g（表3和表4）。

2.4 鹿场舍内气载需氧菌在Andersen－6级空气微生物采样器各层上的分布比例

5个鹿场舍内气载需氧菌在Andersen－6级空气微生物采样器6个层级上的分布情况为：1（＞7μm）层占20%；2（4.7μm～7μm）层占18%；3（3.3μm～4.7μm）层占26%；4（2.1μm～3.3μm）层占16%；5（1.1μm～2.1μm）层占12%；6（0.6μm～1.1μm）层仅占8%。

表2 鹿舍内气载需氧菌、气载革兰阴性菌和气载真菌浓度Table 2 Concentrations of airborne aerobic bacteria，airborne Gram－negative bacteria and aerobic fungi in deer houses

表3 鹿场舍内粪便中革兰阴性菌和内毒素浓度Table 3 Concentrations of the Gram－negative bacteria and endotoxin of faeces in deer houses

表4 鹿场舍内饲料中革兰阴性菌浓度和内毒素浓度Table 4 Concentrations of the Gram－negative bacteria and endotoxin of feed in deer houses

2.5 鹿场舍内气载革兰阴性菌在Andersen－6级空气微生物采样器各层上的分布比例

5 个鹿场舍内气载革兰阴性菌在Andersen－6级空气微生物采样器6 个层级上的分布情况为：1（＞7μm）层占21%，2（4.7μm～7μm）层占16%，3（3.3μm～4.7μm）层占28%，4（2.1μm～3.3μm）层占20%，只有15%的革兰阴性菌分布在5（1.1μm～2.1μm）、6（0.6μm～1.1μm）层上。

3 讨论

本试验采用国际标准的Andersen－6级撞击式空气微生物采样器和AGI－30液体冲击式空气微生物采样器对山东省境内不同地区的5处鹿场舍内空气微生物及内毒素进行检测。本实验中，鹿舍中的气载内毒素含量介于0.085×103EU／m3～1.380×103EU／m3之间，虽然其含量都没有超过引起人的肺炎的标准（2 000EU／m3），但测得的气载内毒素含量已经超过了人类的推荐标准（2EU／m3），且部分浓度超出了人的无影响水平（100EU／m3）。值得注意的是，我们是在正常的工作时间内进行的内毒素的检测，如果是在处理鹿舍内粪便垃圾或鹿群出栏时，空气中的气载内毒素含量可能会更高。因此，长时间暴露在这样的环境下，会对饲养人员和鹿会造成潜在的危害。然而，舍内气载内毒素含量具体达到多少后会对饲养人员和鹿群的健康造成影响，目前还不得而知，还有待进一步的研究。通过对鹿场舍内气载内毒素与需氧菌浓度和革兰阴性菌浓度的相关性分析可知，两者之间没有必然的相关性，其r值分别为0.26和0.22。究其原因可能有以下几点：一是内毒素在空气中可以附着在尘埃等微粒上悬浮于空中数月，其含量不断的积聚；二是气载革兰阴性菌存活的时间很短，其活性会在采样时部分丧失；三是通过本试验可知，鹿场舍内的粪便和饲料中内毒素的含量都非常高，粪便和饲料中的内毒素很可能是气载内毒素的重要来源。因此，对鹿场舍内气载内毒素水平的评估不能仅仅通过测量细菌气溶胶的浓度来得出，而应多方面结合起来进行检测。

国际标准的Andersen－6级撞击式空气微生物收集器可以采集到的粒径范围在0.6μm～20μm，能够统计各种直径粒子的数量，并估计粒子向外传播的距离和进入呼吸道的深度，间接地推断其对人及动物体能够造成的危害程度。3层和4层所能采集到的粒径范围在2.1μm～4.7μm 之间，这些颗粒能够进入人和畜禽的支气管，甚至能够到达细支气管［11］。本试验中，有42%的气载需氧菌分布在3层和4层上；有48%的气载革兰阴性菌分布在3层和4层上。虽然它们的浓度不高，但在一定程度上也增加了饲养人员和动物患呼吸道疾病的可能性的增加，一旦饲养人员和动物的免疫力低下的时候，很容易引起疾病。5层和6层所能采集到的粒径范围在0.6μm～2.1μm 之间，虽然分布在这两层级上的粒子占很小的一部分（本实验中，有20%的气载需氧菌分布在5层和6层上；有15%的气载革兰阴性菌分布在5层和6层），但是这些粒子的空气动力学直径很小，它们能够进入饲养人员和动物的肺的更深部位，甚至能够到达肺泡，对饲养人员及动物的健康形成很大的威胁。

本试验中，鹿舍内粪便中革兰阴性菌的浓度介于0.87×106CFU／g～7.85×106CFU／g之间，内毒素的含量介于0.52×105EU／g～6.48×105EU／g之间；饲料中革兰阴性菌的浓度为0.27×105CFU／g～3.60×105CFU／g；饲料中内毒素的浓度为1.58×103EU／g～6.25×103EU／g。革兰阴性菌和内毒素的含量均远远的高于空气中两者的含量，对饲养人员和动物的健康存在很大的威胁。因此，在鹿场日常的饲养管理中，饲养人员应该及时的清理鹿舍内的粪便和剩余的饲料。

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