陈亨利，陈龙，康元环，莫金龙，单晓枫，李影

（吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118）

水环境中致病微生物活的非可培养状态研究进展

陈亨利，陈龙，康元环，莫金龙，单晓枫∗，李影∗

（吉林农业大学动物科学技术学院，长春130118）

细菌的“活的非可培养状态（VBNC）”是指细菌在不良环境下形成的一种特殊状态。常规检测方法不能检测出此状态下的细菌，给食品安全、公共卫生带来了隐患。现已发现的VBNC状态细菌大多数是水生细菌，包括很多种致病菌。现对近些年水环境中致病微生物VBNC状态的形成与检测、生物学特性及复苏的研究现状进行综述，希望能够对VBNC状态水生致病微生物引起疾病的防治起到积极作用。

活的非可培养状态；水环境中致病微生物；检测方法；生物学特性

活的非可培养状态（viable but non－culturable state，VBNC），即细菌在不良环境条件下，细胞缩小成球形，常规培养方法不能生长繁殖，但仍具有代谢活性，并且在一定条件下能够复苏的特殊存活形式。许多革兰氏阴性菌（G－）和一些不产芽孢的革兰氏阳性菌（G＋）在不利于生长的条件下都可能进入活的非可培养状态。

弧菌属和气单胞菌属细菌是常见的水环境致病微生物，其中很多种都能够进入VBNC状态。常规方法不能检测出进入VBNC的细菌，在此状态下细菌仍保持着潜在的致病力［1］。因此鱼塘中若存在VBNC细菌，条件适当时会发生相应水产疾病从而造成巨大经济损失甚至危害人类生命健康。

一些学者已经开始关注VBNC状态细菌对公共卫生的影响［1］，近年来分子生物技术和基因工程技术的应用与完善，推动了这一领域的研究。研究VBNC状态对公共卫生、流行病学、微生态学等学科有着重要意义。本文对近年来水环境中致病微生物的VBNC状态研究进展进行综述。

1 活的非可培养状态概述

1982年徐怀恕等［2］通过研究霍乱弧菌（Vibrio cholerae）和大肠埃希菌（Escherichia coli）的存活规律而首次提出了活的非可培养状态这一概念。在VBNC状态被报道之前，人们普遍认为细菌不再生长繁殖即为死亡状态。而VBNC状态的致病菌仍具有潜在的致病性，在适当条件下能够复苏，复苏后仍然具有毒力［3］。至今已有报道的20个属的60多种细菌能够进入VBNC状态［4］，许多水环境中的致病微生物都存在VBNC这一特殊状态，如杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、杀鱼巴斯德氏菌（Pasteurella piscida）、鳗弧菌（Vibrio anguillarum）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、创伤弧菌（Vibrio vulnificus）、荧光假单胞菌（Pseudomonadaceae Fluorescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonadaceae Putida）、迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）等（表1）。许多研究人员正应用不同水环境致病菌进行VBNC实验，以期发现更多能够进入VBNC状态的细菌。

表1 常见能够进入VBNC的水环境致病菌种类［4］

2 水环境中致病微生物VBNC状态的诱导

细菌世代中会受到许多环境方面的压力，使细菌生长受到抑制进而转变为一种类似休眠的特殊状态，即VBNC状态。Wolf和Oliver报导了细菌在包括低温、寡营养和不同渗透压等各种环境压力下能够进入VBNC状态［5］。不同细菌进入VBNC需要的环境条件不尽相同，通常细菌处于不利于生长的环境下更容易进入VBNC状态［6］。温度和寡营养条件是诱导细菌进入VBNC状态的主要因素。

2.1 温度 温度是影响细菌进入VBNC的重要因素之一，且常常伴有其他方面如营养条件的协同作用。大多数细菌，如弧菌，对低温度较敏感［7］，仅有少部分细菌在较高温度下能够进入VBNC状态，Rollins和Colwell［8］对空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）的研究发现，空肠弯曲杆菌在30℃条件下比在4℃条件下更快地进入VBNC状态，Rahman等［9］通过对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的研究，发现25℃时的细菌存活数量比5℃要多。然而水环境中致病菌通常于30℃条件下培养，低温对这些细菌的影响相对较弱，有些细菌如维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）甚至在4℃环境下仍能缓慢生长。这证明不是所有水环境中致病菌都会在低温诱导条件下进入VBNC状态，还有一部分细菌如温和气单胞菌（Aeromonas sobria）等，温度对它们的影响较小。

2.2 营养条件 通常细菌在环境中长时间得不到充足的营养物质，便有可能会进入VBNC状态。低温度与寡营养共同作用会加速促进细菌进入VBNC状态。Rahman等［9］将嗜水气单胞菌于25℃，0.35%的NaCl溶液中培养50 d进入VBNC状态。潘高山等［10］用湖水在室温下培养温和气单胞菌（Aeromonas sobria），仅4 d后就有90%的细菌进入VBNC状态。上述研究表明，当环境营养水平低下时，水环境中致病菌会进入VBNC状态以保持自身代谢活性。

2.3 其他因素 通常盐度或渗透压对肠道菌群影响较明显，而对水生细菌影响相对较弱。光照和辐射会对水生致病菌产生一定的影响，但也与细菌种类有关，如Hoff等［11］的研究中，光对海水中的杀鲑弧菌（Vibrio salmonicida）及鳗弧菌（Vibrio anguillarum）没有明显影响。

3 水环境中致病微生物VBNC状态的检测

目前对VBNC细菌的检测尚无统一标准，而利用平板计数法观测可培养菌数是检测的第一步。通过平板计数法确定可培养菌落数为零时，再根据以下方法对细菌是否进入VBNC状态进行检测。

3.1 活菌直接技术法 要检测VBNC菌，首先要确定活菌数，只有可培养数为零而活菌数不为零的细菌才存在VBNC状态。活菌直接计数法（direct viable counting，DVC）是目前常用的检测方法之一。利用萘啶酮酸——一种DNA多聚酶抑制剂，刺激待检菌液，由于DNA合成受到萘啶酮酸的抑制，菌液中的活菌只能生长而不能分裂。将萘啶酮酸添加入细菌培养物中，培养6 h后进行吖啶橙染色，荧光显微镜观察，可观察到活细菌变长，而VBNC状态的细胞是椭圆形的［12］。

3.2 荧光显微镜检测 荧光显微镜的一种快速检测方法是使用LIVE／DEAD试剂盒进行检测。LIVE／DEAD试剂盒基于细胞膜的完整性进行检测，其中包含两种荧光染料：SYTO－9和碘化丙啶（PI）。SYTO－9能够渗透进入完整的细胞膜，将核酸染色，激发出绿色荧光；PI只能渗入破损的细胞膜，将核酸染色后激发出红色荧光。在落射荧光显微镜镜下，发出绿色荧光的为活细菌，发出红色荧光的为死细菌［13］。此方法简便快速，使用范围广泛，并且可配合流式细胞仪进行检测。

3.3 分子生物学检测 分子生物学方法具有很高的灵敏性和特异性，如果有适当的特异性引物，就能够对样本中的细菌DNA片段进行特异性扩增，这种方法不需要对细菌进行培养，能够判断不能进行培养的样本中是否有细菌存在，然而却不能检测出细菌是否存活。相对于细菌的DNA，mRNA的半衰期非常短，仅有2～3min，因此可以用基于mRNA的检测方法对细菌进行VBNC的判断，可靠性很高。2012年潘乐等［14］利用RT－qPCR建立了VBNC状态细菌的检测方法，结果显示良好。Gary等［15］应用RT－PCR联合芯片杂交技术对弧菌的stx1基因进行VBNC检测，结果表明此方法灵敏性、可靠性均较好。

3.4 基于细胞呼吸的检测方法 判断细菌是否为VBNC状态的其他方法还有利用细菌的氧化还原能力进行检测，5－氰基－2，3－二（4－甲基苯基）四唑氯化物（5－cyano－2，3－ditolyl tetrazolium chloride，CTC）是一种电子受体物质，细菌的呼吸过程能够使无色的CTC还原为红色。将一定浓度的CTC添加至细菌培养物中，避光条件下室温培养，显微镜观察或应用流式细胞仪进行检测，能够看到具有红色荧光的细菌即为活细菌［16］。此方法操作简便，但所有细菌是否都能降解CTC还不清楚［17］。

4 VBNC状态水环境中致病微生物的生物学特性

4.1 VBNC时细菌形态变化 大多数进入VBNC的细菌都会发生程度不一的形态改变。且通常杆菌和弧菌会变短呈球杆状甚至变为球状。虽然细菌的形态发生了变化，但细菌结构没有改变，细胞质、细胞膜、细胞壁、外膜仍然完整，并具有正常状态下的表面蛋白、毒力因子。极少数细菌进入VBNC状态后细胞完整性被破坏，Chiu等［18］观察到黄色荧光蛋白（YFP）标记的副溶血弧菌骨架蛋白MreB在细菌进入VBNC状态后降解为小片段。Zhong等［19］用透射电镜观察VBNC状态的辛辛那提弧菌（Vibrio cincinnariens）发现内膜和外膜之间出现了较大空隙。杜萌等［20］在鸡胚尿囊腔中成功复苏了VBNC的迟钝爱德华氏菌（Edwardsiella tarda），并用电镜观察，发现复苏后的细菌形态与正常细菌没有区别。上述研究表明当细菌复苏后，其形态能够恢复正常。

4.2 耐药性 Ben等［21］的研究发现，正常、VBNC状态和复苏后的河流弧菌，药敏试验的结果几乎一致。同样地，其他一些学者对VBNC状态的细菌研究证明正常细菌和VBNC状态下以及复苏后的细菌其耐药性方面并无差异［22－23］。

4.3 致病性 进入VBNC的细菌会保留一部分毒力因子，因此有着潜在的毒力，复苏后便会表达而发生疾病。有的细菌甚至在VBNC状态仍具有致病性。Saux等［24］应用RT－PCR技术检测VBNC状态下的创伤弧菌（Vibrio vulnificus），检测到了溶血毒素基因的mRNA，说明在VBNC状态下溶血毒素基因仍在表达。Ben等［25］对溶藻弧菌的研究发现VBNC状态下的溶藻弧菌具有致病性。钟琳红等［26］用RT－PCR检测VBNC状态哈维氏弧菌丝氨酸蛋白酶基因Ser和rpoS基因的表达，发现在VBNC状态哈维氏弧菌未表达这两种基因，而正常及复苏后的细胞均能检测到此两种基因的表达，从而推断这可能是哈维氏弧菌能长期保持致病性并持续爆发疾病的原因之一。

5 VBNC状态水环境中致病微生物的复苏

如果细菌的VBNC状态是其维持生命的一种应答机制，那么VBNC状态的细菌应该是能够复苏的。通常认为想要使VBNC状态的细菌复苏需要恢复适宜细菌生存的环境。有些细菌如弧菌仅仅使温度上升就能够使其恢复可培养能力，有些细菌则需要其他条件如添加营养物质，解除渗透压等，或将非可培养细菌导入宿主内进行复苏。Thomas等［27］将VBNC状态的希利氏弧菌（Vibrio shiloi）和塔斯马尼亚弧菌（Vibrio tasmaniensis）的培养条件恢复至20℃，两种细菌均恢复了可培养能力；Morris等［28］将原绿球菌（Prochlorococcus）置于富营养环境时，可迅速生长；Baffone等［29］利用Balb／C小鼠作为宿主，成功复苏了溶藻弧菌和哈维氏弧菌等海洋弧菌。此外，有些VBNC细菌的复苏并不是一步完成的，Ben等［21］将VBNC状态6年的河流弧菌进行复苏，经过48 h培养后仅恢复了β－半乳糖苷酶和氧化酶活性，而继续培养3个月后才恢复了正常河流弧菌的全部生物活性，并且复苏后的细菌各种特性均与原菌相同。

但是，对于细菌是否为VBNC状态复苏生长抑或剩余可培养细菌生长而成，目前还存在一些争论。Jiang等［30］通过对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）升温复苏的研究认为，所谓的复苏其实是残存的可培养细菌重新开始生长；而Whiteside等［31］经过一系列稀释、细菌重新生长时间及添加营养物质等试验综合分析，认为创伤弧菌（Vibrio vulnificus）确实存在着复苏的现象。但由于VBNC状态的复苏机理尚不清楚，因此不同细菌复苏条件不尽相同，甚至有些VBNC细菌还没有成功复苏的报道。1998年Mukamolova等［32］在藤黄微球菌的培养上清液中发现了一种复苏促进因子（resuscitation－promoting factor，Rpf），这一发现可能是研究VBNC状态细菌复苏的关键，但在水生致病微生物领域鲜有应用Rpf进行复苏的报道。

6 研究VBNC状态对水环境中致病微生物检测的意义及展望

VBNC状态的水环境中致病菌在适当条件下能够转变成为正常细菌，并恢复其致病力。而常规检测方法检测不出处于这种特殊状态的致病微生物，这就为病原的检测、疾病的起因和防治研究提供了新的思路。例如当检测鱼塘中病原菌时，不仅要用传统检测方法来检测，同时还应利用新兴的VBNC病原菌检测技术，以免一些细菌逃脱检测而造成未来可能发生的疾病流行。

细菌VBNC状态的出现，对食品安全、公共健康带来了新的挑战，能否检测出VBNC状态下的水环境中致病微生物，关系到人民群众的生命财产安全。而在环境中，应用传统微生物培养手段只能够检测出环境总病原菌中的小部分，而大多数细菌是以VBNC状态存活，不能够直接检测出病原菌，因而给渔业带来了隐患。研究细菌的VBNC状态机制，能够加深人们对细菌的了解，有利于进一步制定有效杀灭病原菌的措施。

VBNC状态的发现对微生物学和微生态学来讲也是一种机遇，近年来抑制性消减杂交技术（SSH）越来越多地应用于VBNC状态基因差异的分析中，李文博等［33］应用抑制性消减杂交技术构建cDNA文库，对鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）进行了VBNC的鉴定，同样地，这种技术也可以应用于水环境中致病微生物的VBNC检测中。希望在不远的将来，种种VBNC的检测技术能够发展成熟，从而在上市前的质检环节断绝VBNC状态水生致病菌的隐性污染，为食品公共安全提供有力的技术保障。

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（编辑：陈希）

Progress in Research on Viable but Non －culturable State of Pathogenic M icroorganism in W ater Environment

CHEN Heng－li，CHEN Long，KANG Yuan－huan，MO Jin－long，SHAN Xiao－feng∗，LIYing∗
（College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Bacteriamay form the exceptional and“viable but non－culturable（VBNC）”state under themalnourished environment.The VBNC state of bacteriamay notbe detected by conventional detectionmethod，bringing hazards to the food safety and public health.Most of the VBNC bacteria which have been discovered now are commonly aquatic bacteria，including many kinds of pathogenic bacteria.This paper describes the research of formation，detection，biological characteristics and recovery of pathogenic microorganism in water environment，which may play a positive role in prevention and control of diseases caused by the VBNC state of pathogenic microorganism.

viable but non－culturable；pathogenicmicroorganism in water environment；detectionmethod；biological characteristics

��杜萌.几种常见致病菌的活的非可培养状态研究［D］.中国海洋大学，2007.

10.7666／d.y1112118.

2014－12－08

A

1002－1280（2015）02－0052－06

S852.6

国家自然科学基金项目（31201927）

陈亨利，硕士，从事动物微生物学研究工作。

李影，E－mail：thliying＠163.com；单晓枫，E－mail：sxf1997＠163.com