黎文君

[摘要]目的：研究比较不同方法检测（MRSA）的效果。方法：将从临床感染标本分离获得的148株金葡菌菌株分别采用头孢西丁、苯唑西林纸片扩散法、基因聚合酶链反应（PCR）法检测MRSA菌株，以采用基因聚合酶链反应（PCR）法作为判断MRSA的“金”标准。并用琼脂稀释法测定148株葡萄球菌对青霉素、红霉素等10多种抗菌药物的药物敏感性。结果：头孢西丁纸片法对MRSA的检测灵敏度为93.18%，特异度为95%，漏诊率为6.82%，误诊率为5%，Youden指数为0.818；苯唑西林纸片法对MRSA的检测灵敏度为81.82%，特异度为76.67%，漏诊率为18.18%，误诊率为23.33%，Youden指数为0.585，说明苯唑西林纸片法对MRSA的检测准确性低于头孢西丁纸片法。结论：PCR技术检测MRSA快速且敏感性和特异性强，可作为首选鉴别方法。头孢西丁纸片扩散法使用方法简单，对实验条件无特殊要求，较苯唑西林纸片扩散法结果更准确。

[关键词]耐甲氧西林金葡菌；头孢西丁纸片扩散法；苯唑西林纸片扩散法

中图分类号：R446 文献标识码：B 文章编号：2095-5200（2015）01-074-02

金黄色葡萄球菌是临床常见的高毒性细菌，是肺炎、肠炎、心包炎、脓毒症以及局部化脓炎症主要病原菌。部分金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解B-内酰胺环，表现为对青霉素的耐药。随后研发出的甲氧西林为耐青霉素酶的半合成青霉素，但耐甲氧西林金葡菌（MRSA）已成为全世界范围内的重要病原菌。目前对MRSA的检测主要围绕耐药表型及基因型进行，为此，我们对美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐鉴定MRSA的头孢西丁纸片扩散法和苯唑西林纸片扩散法与PCR检测法进行了比较，以寻找适合医院实验室检测MRSA的简单而可靠方法。

1.资料与方法

1.1菌株来源

本次研究全部188株金黄色葡萄球菌菌株取自于2013年我院各临床科室，其来源主要为患者痰液、咽拭子、深静脉置管、患者脓液、血液、尿液、坏死组织。

1.2材料

头孢西丁纸片、苯唑西林纸片、抗菌药物纸片购自中国生物制品研究所，抗菌药物纸片主要包括：青霉素、罗红霉素、阿奇霉素、头孢噻肟、万古霉素、克林霉素、头孢呋辛、奈替米星、阿米卡星、培氟沙星、头孢唑林。

细菌培养基为英国BBL公司生产。

基因聚合酶链反应PCR扩增仪PE-9700美国PE公司生产。电泳检测装置英国BBL公司生产。

1.3实验方法

1.3.1头孢西丁纸片扩散法 将金葡萄菌样本调制成1.5×10CFU/mL浓度，并涂抹于4mm厚的MH琼脂平板上，将头孢西丁纸片贴于平板上，35℃温度下孵化24h。抑菌圈直径≥13mm为敏感，≤10mm为耐药。

1.3.2苯唑西林纸片扩散法 金葡萄菌样本调制为1.5×10SCFU/mL浓度操作，将调制后标本涂抹于4mm厚MH琼脂平板上，将苯唑西林纸片贴于琼脂板上，35℃温度下孵化24h。抑菌圈直径≥20mm为敏感，≤18mm为耐药。

1.3.3基因聚合酶链反应（PCR）法 将金葡萄菌样本调制成3×108CFU/mL浓度，取10止菌悬液，滴入50μLDNA提取液，操作按PCR操作说明书进行。于100℃下行水浴15min，20000r/min离心，离心时间为10min，去除杂质，取5μL上清液扩增。取10止扩增液置于2.0%琼脂糖的TRB缓冲系统中电泳，于紫外透射下检测。出现1000bp条带判定为阳性。

1.4统计方法

所有收集数据录入Excell2003，在spss10.0中进行统计分析。计数资料用卡方检验，检验水准取a=0.05。

2.结果

2.1两种不同纸片扩散法与PCR检测法比较

经PCR法检测148株菌株中耐甲氧西林金葡菌（MRSA）88株，甲氧西林敏感金葡菌60株。以此为标准，头孢西丁纸片法对MRSA的检测灵敏度为93.18%，特异度为95%，漏诊率为6.82%，误诊率为5%，Youden指数为0.818，说明头孢西丁纸片法对MRSA的检测具有较高的准确性。具体见表1。

苯唑西林纸片法对MRSA的检测灵敏度为81.82%，特异度为76.67%，漏诊率为18.18%，误诊率为23.33%，Youden指数为0.585，说明苯唑西林纸片法对MRSA的检测准确性低于头孢西丁纸片法。具体见表2。

2.2对MRSA的耐药性分析

采用Kirb-Bauer（K-B）法进行药物敏感性实验，结果：MRSA对青霉素100%耐药，对万古霉素完全敏感，对罗红霉素、阿奇霉素、头孢噻肟、克林霉素、头孢呋辛、奈替米星、阿米卡星、培氟沙星、头孢唑林部分敏感。

3.讨论

金黄色葡萄球菌又被称为“嗜肉菌”、“金葡萄”，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是由金黄色葡萄球菌演变出的一种新型耐药型金黄色葡萄球菌，其被称为超级细菌，除万古霉素外，几乎可抵抗其他所有药物。耐药型金黄色葡萄球菌，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，其耐药机制可能为：（1）病原菌自身固有耐药性，这种固有耐药性是由细菌染色体介导所得，与细菌自身生产的一种青霉素结合蛋白（PBP）有关，这种蛋白优势细菌在B-内酰胺类抗生素环境中依旧可以生存。（2）获得性耐药，获得性耐药多由质粒介导而成，部分菌株可通过耐药因子生成大量的B-内酰胺，进而导致耐青霉素酶活性消退，最终出现耐药特征。有学者研究发现，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌不但可以通过生成B-内酰胺形成耐药性，还可通过改变抗生素作用靶向，降低膜通透性以及生成修饰酶等机制来抵抗大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类等抗生素药效。此外，国外有研究已发现万古霉素耐药性金黄色葡萄球菌。正是因为高耐药的金黄色葡萄球菌诱发感染疾病的难治性，临床很重视耐药菌检测。

目前，耐药性金黄色葡萄球菌检测方法主要有纸片扩散法、基因聚合酶链反应（PCR）法、稀释法检测诱导试验等。其中纸片扩散法具有检测速度快、操作简便、价格低廉，可直观反应检测结果。但金黄色葡萄球菌表达情况是各不相同的，这也导致部分纸片扩散检测存在一定误差。基因聚合酶链反应（PCR）法则是临床公认的金黄色葡萄球菌检测标准，但检测设备导致检测费用高昂，难以在实验室内常规开展。本次研究的两种纸片法，头孢西丁纸片法对MRSA的检测灵敏度为93.18%，特异度为95%，阳性似然比为9.32，Youden指数为0.818，苯唑西林纸片法对MRSA的检测灵敏度为81.82%，特异度为71.67%，阳性似然比为3.068，Youden指数为0.585，头孢西丁纸片法对MRSA的检测准确度高于苯唑西林纸片法。使用头孢西丁纸片扩散法检测MRSA方法简便而有效，并且实验条件也无特殊要求。