朱义保，谢彤，杨亮亮，万磊

(江西省妇幼保健院，江西 南昌 330006)

大量的流行病学和分子生物学研究资料表明，人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染与宫颈癌及癌前病变关系密切，是宫颈癌的主要危险因素。研究发现在HPV致癌过程中，常发生HPV E2基因的缺陷，E2完整性遭到破坏，引起致癌性基因E6、E7过量表达，高表达的E6和E7通过与细胞抑癌基因P53和Rb蛋白产物作用并使之失活，导致细胞无限制生长进而引起癌变[1]。因此在本课题中，我们以感染HPFV16的不同宫颈病变为标本，提取DNA，用定量PCR的方法分析HPV16 E2/E7的比值，描述病毒的存在状态，探讨病毒整合与宫颈病变程度的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择来我院诊治的住院患者，用塑料毛刷取样器采集宫颈脱落细胞，根据患者的病理结果和HPV16感染情况，选取慢性宫颈炎21例，CINⅠ4例，CINⅡ22例，CINⅢ 23例，宫颈癌28例。这些患者无子宫切除术史、无急性生殖道炎症、无盆腔放射治疗史、无细胞学检查异常或宫颈上皮内瘤变史、非月经期、非孕期、患者检查前24h未进行性生活、药水冲洗及阴道用药等。

1.2 主要试剂及仪器 HPV16质粒(P1203)由美国Addgene公司惠赠。DNA提起试剂盒、质粒提取试剂 盒 、PCR 试 剂 、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂等购自为北京天为时代公司，ABI 7300实时荧光定量基因扩增仪为美国Applied Biosystems产品。

1.3 DNA提取 从宫颈管采样，样品分2份，一份做人乳头瘤病毒分型检测，另一份备用，对于人乳头瘤病毒分型检测HPV16阳性的标本，取相应的备用样品提取DNA，相关步骤参见北京天为DNA提取试剂盒。为确认样品HPV16的感染，对提取后的DNA进行HPV16 E7基因扩增，通过凝胶电泳确认样品存在HPV16感染。

1.4 E2和E7基因定量PCR扩增条件 引物由华大基因公司合成，HPV16 E2上游引物 5’-TGCGCCTAGAATGTGCTATTTA-3’，下游引物 5’-TCTTTGATACAGCCAGTGTTGG-3’，扩增片度长93bp；HPV16 E7 上游引物 5’-TGCAACCAGAGACAACTGAT-3’，下游引物 5’-TGTCTACGTGTGTGCTTTGT-3’，扩增片段长183bp。总反应体系为20μl， 包括 2μl DNA 模板，0.5μl正反引物，10μl SuperReal PreMix Plus， 加 ddH2O 至 20μl， 定量PCR扩增条件为95℃预变性15min，95℃变性10s，57℃复性20s，72℃延伸20s，40次循环扩增反应结束。

1.5 标准曲线的绘制、游离型和混合型HPV16的界 定 及 标 本 测 定 以 103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl 的 HPV16质粒为模板，每个浓度检测6次，对E2和E7基因进行PCR扩增，取不同批次不同浓度下E2和E7基因的CT均数，构建标准曲线，并取同批次不同浓度下E2/E7比值95%参考值的下限，作为区分游离型和混合型HPV16的临界值；样品DNA根据E2和E7基因的标准曲线，计算E2和E7基因的量，得出各自E2/E7的比值。

1.6 统计学方法采用SSPS17.0软件 应用t检验、卡方分析对数据进行处理及统计学分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 E2和E7基因标准曲线的制定 为保证数据的可靠性，我们重复了 6次以 103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl的HPV16质粒为标准浓度的检测，计算不同批次不同浓度下E2和E7基因CT值的平均值、标准差及变异系数，在基础上以E2和E7 CT值的平均值构建标准曲线。结果如图1所示，E2和E7基因扩增曲线良好，实验所得标准曲线相关系数R2均大于0.97，表明Ct值与起始拷贝数的对数值线性关系良好，6次实验结果的变异系数均数小于4%，表明实验重复性好，实验结果可靠。

图1 E2和E7基因的标准曲线

2.2 HPV16存在状态的认定 在HPV16整合过程中，E2基因常缺失，理论上可认定E2/E7＝1是游离型，0＜E2/E7＜1 为游离和整合的混合型，E2/E7＝0为整合型，但在E2和E7基因的实际扩增中，可存在一定随机误差，游离状态下E2/E7比值会在1上 下 浮 动[6,7]， 因 此 以 103copies/μl、104copies/μl、105copies/μl、106copies/μl、107copies/μl 的 HPV16质粒为模板，每个浓度检测6次，得到了30个E2/E7比值，所得值介于0.76～1.24之间，95%参考值范围为 1.04±0.27，即 0.77～1.31，因此本研究所采用以下标准来判断HPV16的存在状态，认为：E2/E7=0为整合型，E2/E7≥0.77为游离型，0

2.3 HPV16存在状态与宫颈病变的关系 根据上述HPV16认定存在状态的标准，发现慢性宫颈炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌HPV16的整合率分别为 4.00%、9.09%、13.04%、10.71%， 统计显示HPV16整合率在慢性宫颈炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌中分布的差异无统计学意义(P=0.55)；因混合型HPV16中也有病毒的整合，因此把混合型与整合型HPV16合并，得出HPV16总整合率分别为 48.00%、59.09%、65.22%、75.00%， 分析显示HPV16总整合率在各宫颈病变程度间亦不显著(P=0.23)，HPV16总整合率在宫颈病变的分布亦无差异。见图2。

图2 不同宫颈病变的HPV16状态分布

3 讨论

人乳头瘤病毒的感染是宫颈癌发生的致病因素，目前对HPV类型及数量的检测有重要的应用价值，但其对预测肿瘤的发生发展及预后作用不大[2]。高危型HPV的持续感染，病毒DNA会整合入宿主细胞染色体脆性部位，导致病毒基因表达的失调、宿主基因的不稳定甚至细胞癌基因的激活[3]，因此研究HPV病毒整合对探讨宫颈癌发生发展机制，及预测宫颈病变的转归有重要意义。在本课题中，我们以感染HPFV16的不同宫颈病变为对象，用定量PCR方法分析HPV16整合情况，描述病毒的存在状态，探讨HPV16病毒整合与不同宫颈病变的关系。

在本研究中，我们发现慢性宫颈炎/CINⅠ的HPV16整合率为4.00%，CINⅡ为9.09%，CINⅢ为13.04%，宫颈癌为10.71%%，HPV16整合率在慢性宫颈炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的分布没有差别，没有统计学意义。因混合型HPV16也存在病毒整合，把整合型和混合型HPV16合并，合并后的的HPV16总整合率在慢性宫颈炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌分别为48.00%、59.09%、65.22%、75.00%，统计显示HPV16总整合率在慢性宫颈炎/CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌的分布中同样没有差别，无统计学意义。我们的结论同国内报道相反[4-6]，同国外报道一致[7，8]，病毒整合率虽随宫颈病变级别升高而增加，但病毒整合与宫颈病变无关。因此我们认为，HPV16病毒整合和宫颈病变关系不明显，在宫颈病变早期HPV16就有48.00%的整合率，表明宫颈病变早期就有HPV16整合发生，病毒整合是宫颈病变的早期事件[9]。

近年来肿瘤形成学认为，肿瘤的发生是由肿瘤干细胞引起的。20世纪欧洲的病理学家就观察到肿瘤是由处于各个分化阶段的肿瘤细胞组成的一个非均匀混合物，类似于一个正常的器官。研究者们此后在一系列的实验中发现，只有小部分肿瘤细胞具有自我更新能力，其他肿瘤细胞不具有这种能力，如白血病、骨髓瘤、结肠癌、胰腺癌等小部分肿瘤细胞能克隆形成集落，仅有这小部分肿瘤细胞在适当的外界信号刺激下能形成肿瘤[10-12]，因而提出了肿瘤干细胞的学说。现已有学者从宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中提取到了的宫颈癌干细胞[13,14]。

目前研究认为宫颈癌干细胞倾向于来源能向柱状上皮或鳞状上皮分化的储备细胞，如在同一张切片上，或同一宫颈组织的连续切片上，能观察到储备细胞增殖、增生、化生、非典型增生直至癌变的各个阶段的连续性和过渡性的组织学图像，提取到的宫颈癌干细胞也表达储备细胞标志角蛋白CK17等[13,15,16]。因此，结合肿瘤干细胞理论和实验数据，我们认为只有发生了HPV整合的储备细胞才有可能发生宫颈病变。在宫颈病变的标本中，样品可能含有储备细胞，但也有鳞状上皮细胞或柱状上皮细胞，特别是早期宫颈病变样本。实验数据表明早期宫颈病变即有高频率的病毒整合，提示除了储备细胞与HPV16发生整合外，鳞状上皮细胞或柱状上皮细胞也可能会与HPV16发生整合，因为存在上皮细胞的整合干扰，这可能是HPV16整合与宫颈病变关系不明显的原因。而且，这种现象也提示，分化成熟的上皮细胞虽发生了病毒整合，也难以获得恶性表型，只有未分化的发生病毒整合的储备细胞才有可能发生恶变，进一步表明了宫颈癌干细胞来源的问题。

综上所述，我们认为鳞状上皮细胞或柱状上皮细胞也能与HPV16发生整合，病毒整合是宫颈病变的早期事件，HPV16整合与宫颈病变程度没有明显的关系。

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