樊丹怡 常 宏 蒋绍艳 邓少洁 何 珊

广东省深圳市妇幼保健院，广东 深圳 518028

实验研究

乌骨藤多糖抗肿瘤作用的实验研究

樊丹怡 常 宏 蒋绍艳 邓少洁 何 珊

广东省深圳市妇幼保健院，广东 深圳 518028

目的：研究乌骨藤多糖的抗肿瘤活性及可能机制。方法：腹腔注射给予S180荷瘤小鼠模型低（100mg／kg）、中（200mg／kg）、高（400mg／kg）剂量的乌骨藤多糖，考察其对荷瘤小鼠抑瘤率、脾脏指数、胸腺指数、IL－2及TNF－α水平的影响。结果：与模型组比较，各给药组均可显著抑制肿瘤生长（P＜0.01），同时，可以明显增加脾脏指数、胸腺指数、IL－2及TNF－α水平（P＜0.05或P＜0.01）。结论：乌骨藤多糖具有一定的抗肿瘤作用，其作用机制可能与免疫调节作用有关。

乌骨藤多糖；抗肿瘤；免疫功能

恶性肿瘤的发病率和死亡率在许多地区和国家均高居首位，严重威胁人类健康和生命，而现有的放疗、化疗等治疗手段均不能令人满意，其中化疗药物具有耐药性、毒副作用大等缺点，严重影响临床效果［1］。因此，寻找低毒、高效的抗肿瘤药物就显得极为迫切。乌骨藤为萝藦科植物通关藤Marsdenia tenacissima（Roxb．）Wightet Am．的藤茎，始载于 《滇南本草》，主产于贵州、云南等地［2］。乌骨藤复方制剂及其单味药材制成的片剂、注射剂等已经应用在直肠癌、胃癌、肺癌、食道癌等恶性肿瘤的治疗中，取得较好效果［3－4］。但迄今为止，乌骨藤的抗肿瘤活性成分尚不明确，其研究主要集中在三萜类、甾体苷类等成分，关于乌骨藤多糖活性研究方面的报道较少［5］。本研究拟通过提取、分离制得乌骨藤多糖，然后通过给予S180荷瘤小鼠乌骨藤多糖30 d后，探讨其是否具有抗肿瘤作用及可能的抗肿瘤机制，为研究和开发以乌骨藤多糖为主要成分的抗肿瘤药物奠定基础。

1 材料

1.1 实验动物及瘤株 昆明种小鼠，健康清洁级，雌雄各半，体重为 （20±2）g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司；S180肉瘤购自美国ATCC细胞库，并定期腹腔接种传代保存。

1.2 药品与试剂 乌骨藤购自本地药材市场，经鉴定为萝藦科植物通关藤Marsdenia tenacissima（Roxb.）Wightet Am.的藤茎；环磷酰胺由江苏恒瑞医药股份有限公司提供；白细胞介素－2（IL－2）检测试剂盒和肿瘤坏死因子－α（TNF－α）检测试剂盒购自南京建成生物。

1.3 实验仪器 Elx800型酶标仪，美国Bio－Tek公司；5417R型超高速离心机，德国Eppendorf公司；AL204型电子天平，瑞士Mettler Toledo公司；2100型紫外分光光度计，美国Unico公司。

2 方法与结果

2.1 实验方法

2.1.1 乌骨藤多糖的提取、分离 乌骨藤经蒸馏水洗净后烘干，粉碎过40目筛，用70%乙醇渗漉；加30倍蒸馏水煎煮3次，每次1h，过滤后合并滤液；滤液加热浓缩至原体积的1／5，加活性炭脱色，过滤；滤液中加适量预冷的95%乙醇，使其终浓度为70%，放置过夜析出沉淀；离心后得沉淀，沉淀用少量蒸馏水溶解，滤去不容物后，再加入适量95%乙醇进行二次沉淀，沉淀物干燥后得乌骨藤多糖；采用苯酚－硫酸法测乌骨藤多糖含量。

2.1.2 荷瘤小鼠模型的建立、分组及给药 60只昆明种小鼠随机分成正常对照组、模型组、环磷酰胺组（20mg／kg）、乌骨藤多糖低（100mg／kg）、中（200mg／kg）、高（400mg／kg）剂量组。按文献 ［6］方法，在无菌条件，取接种7d后生长良好的S180肿瘤细胞，用生理盐水调成2×106个／m l的细胞悬液，除正常对照组外，各组小鼠右前肢接种0.2 ml。接种24h后给药，环磷酰胺组ip给药，隔天1次；乌骨藤多糖组ip给药，每天1次；正常对照组及模型组ip等体积的生理盐水，给药周期为30 d。

2.1.3 乌骨藤多糖的抗肿瘤作用及对脾脏指数、胸腺指数的影响 末次给药后次日称量小鼠体重，眼球取血后，采用颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏和胸腺，计算脾脏指数和胸腺指数，公式如下：

脾脏脂数＝脾重（mg）／体重（g）

胸腺指数＝胸腺重 （mg）／体重 （g）

剖取瘤组织，称重后计算抑瘤率，公式如下：抑瘤率 （%）＝（模型组瘤重－实验组瘤重）／模型组瘤重×100%

2.1.4 乌骨藤多糖对荷瘤小鼠血清IL－2和TNF－α水平的影响 将2.1.3中取得的血样离心后，分离血清，然后按照试剂盒说明书中操作步骤检测荷瘤小鼠血清中IL－2和TNF－α的水平。

2.1.5 统计学分析 采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，用表示连续变量，采用t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2.2 实验结果

2.2.1 乌骨藤多糖的提取、分离 制得的乌骨藤多糖为浅灰色粉末，其提取率为5.1% （相对于被提取的乌骨藤干重），纯度为87.6%。

2.2.2 乌骨藤多糖的抗肿瘤作用及对脾脏指数、胸腺指数的影响 与模型组比较，乌骨藤多糖低、中、高剂量给药组的肿瘤质量均明显减轻（P＜0.01），表明其具有显著的抗肿瘤作用，低、中、高剂量组的抑瘤率分别为22.45%、32.65%和34.69%；同时，与模型组相比，乌骨藤多糖各给药组小鼠的脾脏指数和胸腺指数显著升高（P＜0.05或P＜0.01），而环磷酰胺组中此2项指标则明显降低（P＜0.05或P＜0.01），提示乌骨藤多糖的毒副作用要明显小于环磷酰胺。

表1 乌骨藤多糖的抗肿瘤作用及对脾脏指数、胸腺指数的影响 （±s，n＝10）

表1 乌骨藤多糖的抗肿瘤作用及对脾脏指数、胸腺指数的影响 （±s，n＝10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量／mg／kg脾脏指数／mg／g胸腺指数／mg／g瘤重／g抑瘤率／%对照 — 12.69±2.56** 4.34±0.82**— —模型 — 8.42±1.53 2.11±0.47 0.49±0.12 0.00环磷酰胺 20 8.09±1.31* 1.76±0.82** 0.26±0.09** 46.94乌骨藤多糖（低） 100 9.76±1.28* 2.89±0.94** 0.38±0.11** 22.45乌骨藤多糖（中） 200 10.52±1.65** 3.15±1.16** 0.33±0.08** 32.65乌骨藤多糖（高） 400 11.04±1.88** 3.54±1.02** 0.32±0.13**34.69

2.2.3 乌骨藤多糖对荷瘤小鼠血清IL－2和TNF－α水平的影响 与模型组相比，乌骨藤多糖中、高剂量组的IL－2水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01），而低剂量组虽然有一定程度增加，但差异无统计学意义 （P＞0.05）；与模型组相比，乌骨藤多糖低、中、高剂量组的TNF－α水平均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），且具有剂量依赖关系，以上结果提示乌骨藤多糖的抗肿瘤作用可能是通过提高免疫功能而起作用。

表2 乌骨藤多糖对荷瘤小鼠血清IL－2和TNF－α水平的影响（Pg／ml，±s，n＝10）

表2 乌骨藤多糖对荷瘤小鼠血清IL－2和TNF－α水平的影响（Pg／ml，±s，n＝10）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 剂量／mg／kg IL－2 TNF－α对照 — 442.18±30.78**100.63±15.04**模型 — 321.42±21.17 56.81±9.27环磷酰胺 20 310.69±15.38 82.36±10.22**乌骨藤多糖（低）100 331.42±21.27 67.25±11.48*乌骨藤多糖（中）200 354.33±15.56* 77.85±13.64**乌骨藤多糖（高）400 373.83±20.28**80.08±13.08**

3 讨论

实验结果发现，乌骨藤多糖可不同程度的抑制S180肉瘤的增长，但是抑瘤效果要低于阳性药物环磷酰胺；但环磷酰胺在起到抗肿瘤作用的同时，可以明显降低脾脏指数和胸腺指数，表明其具有较大的毒副作用；而乌骨藤多糖可以增加荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，表明乌骨藤多糖毒副作用较小。新药的研究开发要以安全、有效为准则，其中安全性更为重要［7］。因此，乌骨藤多糖在临床应用方面将会具有较好的前景。

肿瘤的发生、发展过程极为复杂，目前为止，并没有完全阐述清楚；但多项研究表明，免疫功能失调与肿瘤的发生、发展密切相关［8］。机体的免疫功能主要包括体液免疫和细胞免疫，尤其是细胞免疫在清除肿瘤过程中起着主导作用。IL－2和TNF－α为评价机体细胞免疫水平的重要指标，在肿瘤的免疫治疗中受到越来越广泛的重视。多项研究表明，植物多糖除了具有对肿瘤细胞的直接杀伤作用外，还可以通过促进细胞免疫反应而间接发挥杀伤肿瘤细胞的作用［9－10］。本研究通过给予荷瘤小鼠不同剂量的乌骨藤多糖后发现，与模型组比较，低、中、高剂量的乌骨藤多糖均可以增加荷瘤小鼠血清IL－2水平，其中中、高剂量组差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；同时，与模型组比较，各剂量组的乌骨藤多糖也可以显著增加荷瘤小鼠血清TNF－α水平（P＜0.05或P＜0.01）。因此，可以推测乌骨藤多糖可以通过促进免疫因子的产生，增加机体免疫能力，从而起到抑制肿瘤发展的作用。

综上所述，乌骨藤多糖具有一定的抗肿瘤作用，其作用机制可能与免疫调节作用有关。

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Purification and Antitumor Activities of Polysaccharide from Caulis Marsdeniae Tenacissimae

FAN Danyi，CHANG Hong，JIANG Shaoyan，DENG Shaojie，HE Shan
Women and child health hospitial of Shenzhen in Guangdong province，Shenzhen Guangdong 518028

ObjectiveTo investigate antitumor activities and underlyingmechanisms of a water-soluble polysaccharide from Caulis Marsdeniae Tenacissimae.M ethods Marsdeniae Tenacissimae polysaccharides was intraperitoneal injection at three doses（100，200，400 mg／kg）to the S180 tumor bearingmice and antitumor effects，spleen index，thymus index，IL－2 and TNF－αlevelswere evaluated.Results Compared with model group，themedicated groups can significantly inhibit the growth of S180 tumor（P＜0.01），and meanwhile，spleen index，thymus index，IL－2 and TNF－αlevelswere significantly increased（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion Marsdeniae Tenacissimae polysaccharides has the antitumor activity and themechanism might be closely related to the optimizing immune response.

Marsdeniae Tenacissimae polysaccharides；antitumor；immune function

R285.5

A

1007－8517（2015）13－0012－02

2015.05.19）

国家自然科学地区基金项目（编号：81160492）资助。

谭丽萍 （1984－），女，云南西双版纳州人，实验师。

陈文慧，云南中医学院教授。