易 骏 ，吴岩斌 ，吴锦玉，王 涛

（1.福建教育学院，福州 350025；2.福建中医药大学，福州 350122；3.天津中医药大学，天津 300193）

厚朴为木兰科多年生落叶乔木，主要分布在长江以南，多有栽培，资源丰富。一般需要12 a树龄以后的厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.）或凹叶厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.），其入药部位干燥干皮、根皮及枝皮活性成分稳定[1]，期间，每年秋季厚朴叶自然凋落腐烂。厚朴叶为大型叶，长20～45 cm，宽10～25 cm，生物量较大，引起人们对厚朴叶资源利用价值研究的兴趣。近年来研究表明，厚朴叶主要含有木脂素类、黄酮类、生物碱类和挥发油等成分[2-6]，具有抗菌、镇咳、抗氧化和血管舒张等作用[7-10]，其中总黄酮含量约为5.01%[11]。因此，有必要研究其总黄酮的纯化工艺，为进一步开发利用凹叶厚朴叶总黄酮资源提供依据。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂 凹叶厚朴叶采自福建省南平市光泽县境内，经福建中医药大学药学院杨成梓副教授鉴定为凹叶厚朴（Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.）的干燥叶。D101、AB-8、HPD-100、HPD-722、HPD-400、HPD-400A、DM130、DM301型大孔吸附树脂：沧州宝恩吸附材料科技有限公司。槲皮苷对照品（自制），ABTS试剂（美国Sigma公司），DPPH（日本和光纯药株式会社），BHT（海华蓝生物科技有限公司，批号26973），甲醇、乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等皆为分析纯。

1.2 仪器与设备 UV-1800紫外可见分光光度计（日本岛津公司），SHB-Ш循环水式多用真空泵（郑州长城科技工贸有限公司），RZ01C旋转蒸发器（郑州长城科技工贸有限公司），HH-S恒温水浴锅（郑州长城科技工贸有限公司），KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），AR2130千分之一天平[奥豪斯仪器（上海）有限公司]，CP225D十万分之一天平（德国赛多利斯），ELIX5纯水制备系统（厦门精艺兴业科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 凹叶厚朴叶粗粉经乙醇浓度为75%回流提取3次，过滤，合并滤液，回收小体积，3 600 r/min的速度离心10 min，得凹叶厚朴叶样品液，浓度为0.12 g/mL，备用。

2.2 大孔树脂的预处理 根据购于沧州宝恩吸附材料科技有限公司的树脂预处理方法：在树脂柱内加入高于树脂层10 cm的乙醇浸泡4 h，放出浸液，至洗涤液在试管中加水稀释不浑浊并且洗脱液用紫外光谱扫描不得检出吸收峰为止。再用水洗涤至乙醇含量小于1%，即可使用。

2.3 大孔树脂的静态吸附

2.3.1 最佳大孔树脂考察 于100 mL三角瓶中装入已处理好的干树脂各1 g，加入凹叶厚朴叶样品液20 mL，置于摇床中振荡24 h，测定滤液中总黄酮的浓度。过滤上述树脂，加入100 mL 95%乙醇，置于摇床中振荡24 h，测定滤液中总黄酮的浓度。通过计算树脂的吸附率和解吸附率确定最佳树脂。由表1可知，弱极性的HPD722、非极性的HPD100、极性的HPD600、中极性的HPD400A和非极性的HP20对凹叶厚朴叶总黄酮吸附能力较强；而弱极性的DM130、弱极性的HPD722、中极性的HPD400、中极性的DM301和中极性的HPD400A解吸性能效果较好。综合比较，选用效果较好的HPD722和HPD400A两种树脂进行静态动力吸附过程研究，以筛选出最佳的大孔树脂。见表1。

表1 不同型号大孔树脂的吸附率及解吸附率（s）

表1 不同型号大孔树脂的吸附率及解吸附率（s）

解吸附率（%）94.75±6.23 91.29±4.32 86.03±7.28 94.07±5.98非极性 88.58±6.45 HPD100 非极性 88.99±4.58 90.73±7.51 HPD400A 中极性 86.19±6.58 93.52±6.12 HP20 非极性 87.10±6.23 89.71±3.75 DM301 中极性 82.67±3.24 93.33±5.68 AB-8 弱极性 83.71±4.32 89.44±7.58

2.3.2 大孔树脂静态吸附考察 于100 mL三角瓶中装入已处理好的干树脂各1 g，加入凹叶厚朴叶样品液20 mL，置于摇床中振荡，每隔1 h测定厚朴叶中总黄酮浓度，然后计算吸附率，得到静态等温吸附曲线。见图1。

图1 两种树脂的静态等温吸附曲线

综合以上因素考虑，HPD722大孔树脂具有较高的吸附率和解吸附率，故选HPD722大孔树脂纯化凹叶厚朴叶总黄酮工艺。

2.4 大孔树脂的动态吸附

2.4.1 上样浓度考察 取已处理好的6份干树脂,每份7 g，分别湿法装柱（20 mm×28 cm，填装柱体积为36 mL，柱高18 cm），加凹叶厚朴叶总黄酮样品液 稀 释 为 含 生 药 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14 g/mL的溶液各20 mL上样，以1 BV/h的流速进行动态吸附，吸附完成后，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，再用100 mL 95%乙醇洗脱，测定总黄酮回收率，选择最佳上样浓度。结果如图2所示，随着上样液浓度的增加，总黄酮回收率明显增加，且达到一定浓度，总黄酮回收率增加不明显，当上样液浓度为0.1 g/mL时，总黄酮回收率最高。考虑到，上样量小，不利于大规模生产，且上样液浓度为0.12 g/mL的总黄酮回收率与0.1 g/mL相当，综合考虑，应选取0.12 g/mL为最佳上样浓度。见图2。

图2 上样浓度对回收率的影响

2.4.2 上样流速考察 取已处理好的4份干树脂,每份7 g，分别湿法装柱，加凹叶厚朴叶总黄酮样品液含生药 0.12 g/mL，各 20 mL，分别以 1、2、3、4 BV/h流速进行动态吸附，吸附完成后，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，再用100 mL 95%乙醇洗脱，测定总黄酮回收率，选择最佳上样流速。结果如图3所示，随着上样流速的增加，总黄酮回收率明显下降；考虑到大规模生产，且上样流速为1 BV/h的总黄酮回收率与2 BV/h相当，综合考虑，应选取2 BV/h为最佳上样流速。

图3 上样流速对回收率的影响

2.4.3 大孔树脂动态吸附曲线考察 取已处理好的干树脂7 g，湿法装柱，加凹叶厚朴叶总黄酮样品液含生药0.12 g/mL 20 mL，以2 BV/h的流速进行动态吸附，每0.5 BV收集1个流份，测定总黄酮的浓度，得到动态吸附曲线。结果如图4所示，随着总黄酮上样量的增加，流出液中总黄酮的量也随之增加；当上样量为1 BV时有少量总黄酮流出，上样量达到5.5 BV时出现明显泄漏点（泄漏点为初始浓度的1/10），由此确定凹叶厚朴叶总黄酮上样液的最大体积为5.5 BV。

图4 HPD722动态吸附曲线

2.4.4 洗脱溶剂考察 取已处理好的干树脂7 g,湿法装柱，加凹叶厚朴叶总黄酮样品液含生药0.12 g/mL，以2 BV/h的流速进行动态吸附，吸附完成后，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，合并洗脱液；再分别用10%、30%、50%、75%、95%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，测定洗脱液中总黄酮的回收率。结果如图5所示，厚朴叶总黄酮主要集中在10%～50%，10%乙醇洗脱液较少总黄酮，且颜色深，表明含有许多的杂质。因此，洗脱时，先用蒸馏水洗至无色后，用10%乙醇洗去杂质，再用50%乙醇洗脱得到总黄酮。

图5 洗脱溶剂对回收率的影响

2.4.5 洗脱剂用量考察 取已处理好的干树脂7 g，湿法装柱，加厚朴叶总黄酮样品液含生药0.12 g/mL，以2 BV/h的流速进行动态吸附，吸附完成后，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，再用50%乙醇洗脱，每0.5 BV收集1份，测定收集液总黄酮的浓度。结果如图6所示，当洗脱剂用量达到4 BV时，厚朴叶总黄酮基本洗脱完全，所以洗脱剂用量为4 BV。

图6 洗脱剂用量对回收率的影响

2.5 纯化前后凹叶厚朴叶总黄酮纯度的测定 取2.1项制备供试品溶液3份，浓度为0.12 g/mL，以2 BV/h上样，上样体积为5.5倍柱体积，用3.5倍柱体积10%乙醇除去杂质，再用4倍柱体积50%乙醇洗脱，最终得到纯化后的总黄酮，经减压浓缩，得到总黄酮浸膏，备用。测定纯化前后总黄酮纯度，结果见表2。

表2 纯化前后凹叶厚朴总黄酮的纯度（s）

表2 纯化前后凹叶厚朴总黄酮的纯度（s）

纯化前后纯化前纯化后n 浸膏质量（mg）浸膏中总黄酮质量（mg）总黄酮纯度（%）3 3 1 872.61±57.33 513.95±23.05 27.44±0.42 856.04± 6.99 529.74±10.35 61.88±0.74

2.6 纯化前后凹叶厚朴叶总黄酮抗氧化活性评价

2.6.1 供试品制备 纯化前后纯度分别为27.44%和61.67%的总黄酮浸膏，备用。

2.6.2 抗氧化活性的测定 清除DPPH自由基分别取2mL不同浓度供试品的甲醇溶液（20~100 mg/L），加入0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液2 mL，避光反应30 min，以2 mL不同浓度的BHT为阳性对照，空白对照用80%甲醇代替样品溶液，80%甲醇调0，在517 nm波长处测吸光度。以样品浓度和清除率计算IC50值。清除DPPH自由基的能力用半数抑制率IC50表示，IC50越小，清除自由基的能力越强。

式中：A0为空白对照的吸光度，A1为供试品的吸光度。

通过对纯化前后总黄酮清除DPPH自由基测定，结果如表3、图7，凹叶厚朴叶总黄酮具有清除DPPH自由基的活性，并在实验浓度范围内均呈明显量效关系。纯化后总黄酮清除DPPH自由基活性较强，其 IC50为（19.97±0.85）mg/L，纯化前总提物IC50为（44.88±1.31）mg/L。可见纯化后总黄酮清除DPPH自由基活性大大提高。

表3 凹叶厚朴叶总黄酮对DPPH和ABTS自由基的清除作用（s）mg/L

表3 凹叶厚朴叶总黄酮对DPPH和ABTS自由基的清除作用（s）mg/L

自由基 纯化前的IC50 纯化后的IC50 BHT的IC50 DPPH 44.88± 1.31 19.97±0.85 11.13±0.10 ABTS 592.2±13.14 169.78±0.99 90.70±0.98

图7 凹叶厚朴总黄酮纯化前后对DPPH自由基的清除作用

清除ABTS自由基取7 mmol/L的ABTS与2.45 mmol/L过硫酸钾等体积混合23℃暗处反应12~16 h，得到ABTS+。用蒸馏水稀释ABTS+溶液使其在734 nm下的吸光值在0.7±0.02之间。取ABTS+溶液（吸光度在0.7±0.02内）3.9 mL加入0.1 mL 80%甲醇溶解的不同浓度的供试品溶液（100~900 mg/L），摇匀，23℃放置6 min，在734 nm波长处测吸光度。用80%甲醇代替样品作为空白对照。清除ABTS自由基的能力用半数抑制率IC50表示，IC50越小，清除自由基的能力越强。

式中：A0为空白吸光值；A1为样品吸光值。

通过对纯化后总黄酮清除ABTS自由基测定，结果如表3、图8，凹叶厚朴叶总黄酮具有清除ABTS自由基的活性，并在实验浓度范围内呈明显量效关系。纯化后总黄酮清除ABTS自由基活性较强，其 IC50为（169.78±0.99）mg/L、纯化前总提取物IC50为（592.2±13.14）mg/L。可见纯化后总黄酮清除ABTS自由基活性大大提高。

图8 凹叶厚朴叶总黄酮纯化前后对ABTS自由基的清除作用

3 讨论

目前分离纯化总黄酮方法主要有柱层析法、大孔树脂吸附法、高速及高效逆流色谱、薄层层析、双水相萃取法等方法[12]，其中大孔树脂吸附法具有快速、高效、方便、灵敏、选择性好等，而且再生处理比较方便，成本较低，因此被广泛用于分离纯化中药活性成分，但不同型号的大孔树脂，其纯化活性成分的条件差异较大[13]，因此，在应用大孔树脂进行分离纯化时要对树脂的型号进行选择[14]。不同型号大孔树脂主要是由于大孔树脂比表面积、表面电性、能否与化合物形成氢键吸附等[13]，因此需要考察大孔树脂对被纯化产生动态吸附和静态吸附的影响，进而提高对中药活性成分的纯化率[15]。在实验室考察指标设置上充分考虑工业化生产的需求，同时要注意大孔树脂重复使用对工业生产中降低生产成本、节约工时和提高生产效率的意义[16]。按照吸附率、解吸附率方法确定最佳型号大孔树脂为HPD722大孔树脂，其对凹叶厚朴叶总黄酮具有较好的纯化作用，凹叶厚朴叶总提物经HPD722大孔树脂纯化后总黄酮纯度由原来的27.44%提高到61.67%，而且抗氧化活性得到提高，主要是基于黄酮类化合物因具有酚羟基等结构，表现良好的抗氧化活性[17-18]。

自由基与许多疾病的产生有关，如肿瘤、心脑血管疾病、白内障、慢性炎症等疾病[19]。近年来，很多来自自然植物中的提取物已经被证明具有较好的抗氧化活性[1]，其中黄酮类化合物在心血管系统作用和抗肝脏毒作用等方面有着广泛的生理活性[20]。凹叶厚朴叶含有较高的黄酮，并可获得纯度达到61.67%的黄酮纯度，因此有必要深入开展凹叶厚朴叶高纯度黄酮的生理活性研究。

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