梁 铮,柏彩英,罗娅莎,张 文,蓝 锴,李苗苗,周 强△(.广州中医药大学第二临床医学院， 广州 500；.广东省妇幼保健院检验科，广州 5000；.广东医学院，广州 5808)



·论 著·

MALDI-TOF-MS技术快速鉴定临床酵母样真菌的应用评价*

梁 铮1,柏彩英2,罗娅莎1,张 文1,蓝 锴1,李苗苗3,周 强1△(1.广州中医药大学第二临床医学院， 广州 510120；2.广东省妇幼保健院检验科，广州 510010；3.广东医学院，广州 523808)

目的 评价基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)在快速鉴定临床分离的酵母样真菌中的应用价值。方法 收集临床分离的酵母样真菌135株，分别用VITEK MS、API20C和CHROMargar显色培养同时进行鉴定与比较，χ2检验分析VITEK MS和API及显色培养基鉴定结果的准确率，以真菌内转录间隔区(ITS)基因测序作为鉴定结果的金标准，同时比较各种方法在临床使用中的优缺点。结果 VITEK MS、API20C和显色培养基鉴定的准确率分别为98.5%(133/135)、78.5%(106/135)、59.3%(80/135)，经χ2检验分析，差异有统计学意义(χ2=51.996，P<0.05)。结论 MALDI-TOF-MS可将酵母样真菌快速、准确地鉴定到种。

酵母样真菌； MALDI-TOF-MS质谱分析； ITS基因测序

近年来，深部真菌感染发生率和病死率在逐年增加[1]，其中以白色假丝酵母为主，其他酵母菌样真菌也频繁被检出。传统的真菌鉴定方法主要有CHROMagar显色培养基和生化鉴定系统如API20C、全自动微生物鉴定仪Vitek、Microscan及Biolog鉴定系统等，这些检测需较长周期和较高成本，难以鉴定不常见或生化反应相近的真菌；分子学鉴定方法(如荧光杂交和PCR)快速、准确，但对实验室要求较高，难进行推广。基质辅助激光解析/电离-飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)是应用于病原微生物快速检测的一项新技术，不同的病原菌经MALDI-TOF-MS检测可以形成特异性的指纹图谱，将待测病原菌的质谱图与已有质谱图库进行比较，即可确定病原菌种属，拥有快速、稳定、重复性好等特点，本文将探讨法国生物梅里埃VITEK MS质谱仪在临床酵母样真菌快速鉴定中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 试验菌株 收集分离自广州中医药大学第二临床医学院2014年3～12月临床痰、尿液、分泌物、皮肤刮取物、骨髓等标本的酵母样真菌135株，通过真菌内转录间隔区(ITS)序列分析确定菌种分布如下：近平滑假丝酵母菌17株，白色假丝酵母菌32株，光滑假丝酵母菌22株，热带假丝酵母菌21株，克柔假丝酵母菌16株，季也蒙假丝酵母菌9株，皱褶丝酵母菌4株，阿萨丝酵母菌7株，红酵母菌2株，新型隐球菌3株，季也蒙毕赤酵母2株，标本用真菌滤纸保藏法(载体保藏法)-80 ℃冷冻保存。

1.2 试剂与仪器 酵母基因组DNA提取液、PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，API20C 系统酵母菌鉴定试剂盒，CHROMargar显色培养基，VITEK MS(Biomerieux)，PCR仪(ABI9700)，水平电泳仪及凝胶成像分析系统(BIO-RAD)等。

1.3 方法

1.3.1 显色培养基鉴定 按临床常规的表型鉴定流程，沙氏培养基上培养所得真菌菌株均进行菌落形态及镜下形态观察，酵母菌行显色培养基培养，根据菌落颜色判定。

1.3.2 API20C鉴定 按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.3 VITEK MS鉴定 在VITEK MS标本准备工作站，按标准操作规程完成标本准备工作；待所有标本准备完成或整块靶板点位涂满菌，放进检测口检测；检测结束进入MYLA软件对质谱图行进行鉴定。

1.3.4 ITS测序 提取135株菌株的DNA，扩增其ITS基因，回收PCR阳性产物进行测序，具体方法参看文献[2-3]。测序结果通过BLAST检索与GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对，找出与之相似的序列，序列同源性不低于97%确定为同属，同源性不低于99%视为同种[4]。

1.4 统计学处理 使用SPSS13.0软件进行统计分析。计数资料以率表示，组间比较采用χ2检验；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3种方法准确率的比较 VITEK MS、API20C和显色培养3种方法鉴定结果的准确率分别为98.5%(133/135)、78.5%(106/135)和59.3%(80/135)，经χ2分析差异有统计学意义(χ2=51.996，P<0.05)，VITEK MS与API20C两组组间比较同样具有统计学意义(χ2=26.566，P<0.05)。

2.2 VITEK MS、API20C鉴定结果不同菌株的分析 MS与API鉴定结果共有25株菌不一致，API对光滑与近平滑假丝酵母菌，季也蒙假丝酵母菌与新型隐球菌的鉴定有较高的错判率。见表1。

表1 VITEK MS、API20C鉴定结果不一致真菌

2.3 3种方法临床应用特点的比较 VITEK MS、API20C、显色培养3种鉴定方法在临床鉴定中所需时间，经济成本，结果判读等特点的比较见表2。

表2 VITEK MS、API20C、显色培养3种鉴定方法 临床应用特点的比较

注：*所需时间指菌落长出后至鉴定出结果所需时间。

3 讨 论

本试验收集的135株酵母样真菌中使用VITEK MS方法成功鉴定了133株，正确率98.5%与国外文献报道(92.5%～99.0%)接近[5]，明显高于API20C(78.5%)和显色培养鉴定法(59.3%)；2株菌未成功鉴定的真菌ITS测序结果为季也蒙毕赤酵母，MS鉴定为季也蒙假丝酵母菌，前者实则是后者的有性期阶段。试验数据表明VITEK MS能快速、准确、稳定地鉴定临床分离的酵母样真菌。

传统的生物表型鉴定方法虽能准确鉴定大部分的酵母菌，但不常见的菌株则可能鉴定失败[6]。显色培养基一般可鉴定4种常见酵母菌，但不同人在颜色辨别上存在一定差异或显色不典型容易造成鉴定错误，本试验数据表明显色培养正确率明显低于MS和API，其中有1株光滑念珠菌显为蓝灰色(典型的显色为紫色)。API20C试验对光滑与近平滑假丝酵母菌，季也蒙假丝酵母菌与新型隐球菌的鉴定有较高的错判率，对阿萨丝酵母菌、克柔假丝酵母菌也出现错误鉴定。而克柔假丝酵母菌对氟康唑天然耐药，因此API鉴定结果为克柔假丝酵母菌时应结合其他方法确认，以免误导治疗。在本次试验中API20C鉴定正确率78.5%，明显低于国内、国外文献报道[2,7-8]，原因可能是板条浊度判读结果依赖于操作人员熟练程度和所研究菌种构成比等因素导致了研究结果的差异,这也反映了该方法在结果判读方面不够客观，易造成误判。

从临床应用的情况分析，VITEK MS操作简单，实验准备时间和出报告的时间较短，单次检测的成本较低，仪器自动判读结果人为因素影响较少。综合各方面因素，VITEK MS能满足临床微生物实验室快速、准确鉴定病原体的需求。在一些研究中，VITEK MS不能正确地鉴定菌株是因为数据库中标准菌株的图谱有限或菌库尚未包含这些菌株，质谱峰数据不充分导致得分较低。随着该技术的广泛应用，质谱图库数据将会得到进一步的补充，可使鉴定结果更加准确、可靠。

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Application evaluation of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for rapid identification of clinically isolated yeast-like fungi*

LIANGZheng1,BOCai-ying2,LUOYa-sha1,ZHANGWen1,LANKai1,LIMiao-miao3,ZhouQiang1△

(1.SecondClinicalMedicalCollege,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou,Guangdong510120,China;2.DepartmentofClinicialLaboratory,GuangzhouMunicipalMaternalandChildHealthCareHospital,Guangzhou,Guangdong510010,China;3.GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou,Guangdong523808,China)

Objective To evaluate the application value of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS) for rapid identification of clinically isolated yeast-like fungi.Methods 135 strains of clinically isolated yeast-like fungi were collected and identified by VITEK MS,API20C system and CHROMagar Candida at the same time,then the detection results were compared,the accuracy of detected results were analyzed by the χ2test,the identification of the ITS gene sequence of these isolates were taken as the gold standard.At the same time the advantages and disadvantages in the clinical application of these methods were compared.Results The identification accuracy rates of VITEK MS,API20C and CHROMagar Candida were 98.5%(133/135)，78.5%(106/135) and 59.3%(80/135) respectively,the differences were statistically significant (χ2=51.996，P<0.05).Conclusion MALDI-TOF-MS could rapidly and accurately identify yeast-like fungi.

yeast-like fungi; MALDI-TOF-MS; ITS gene sequencing

广东省科技计划项目(2011B031800028)；广东省科技计划项目(粤科社字[2011]106号)。 作者简介：梁铮，男，硕士，主管技师，主要从事微生物耐药机制研究。△

，E-mail：zq_zhouqiang@163.com。

10.3969/j.issn.1672-9455.2015.18.005

A

1672-9455(2015)18-2659-02

2015-04-15

2015-05-15)