逯 蕾，姜爱雯，杜佩珊，班旭霞，刘云宁，梁 江

·论著·

杜鹃素对H2O2诱导的内皮细胞凋亡的保护作用研究

逯 蕾1，姜爱雯1，杜佩珊2，班旭霞1，刘云宁1，梁 江1

目的 研究杜鹃素对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡的保护作用。方法 采用MTT法检测细胞活力,相差显微镜和荧光显微镜观察细胞形态变化。结果 采用5、10、20 μg/mL浓度的杜鹃素处理细胞后，内皮细胞活性呈浓度依赖性增加，细胞存活率提高；与H2O2组相比，细胞皱缩明显减少。杜鹃素20 μg/mL可抑制H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。结论 杜鹃素具有抑制H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的作用。

杜鹃素；内皮细胞；凋亡

0 引言

动脉粥样硬化的发病机制极为复杂，低密度脂蛋白的氧化产生氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是动脉粥样硬化病变发生的中心环节[1]，动脉内膜损伤后,血小板在该处粘附而聚集，随后发生纤维蛋白沉积，形成微血栓，逐渐形成粥样硬化斑块。血管紧张素Ⅱ、活性氧炎性细胞因子和机械扩张等均能诱导内皮细胞凋亡[2]，目前认为各种因素造成血管内皮损伤是动脉粥样硬化病变的始动环节[3]。

杜鹃素(Farrerol)又名法尔杜鹃素，属于二氢黄酮类化合物，其化学名为5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)-6,8-二甲基-2,3-二氢苯并吡喃-4-酮，是满山红及其他杜鹃属药用植物中的一种有效成分[4-5]，现已能人工合成[6-7]。满山红(兴安杜鹃)的主要药理作用表现为：对呼吸系统的作用(包括镇咳、祛痰、平喘)，对心血管系统的作用，镇痛作用，抗肿瘤，利尿作用等[8]。最近有文献报道杜鹃素有很好的抗菌作用[9]。此外，杜鹃素对皮肤烫伤性炎症渗出也有一定的抑制作用[10]。

本实验通过系统的细胞试验,进一步研究杜鹃素对H2O2诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的保护作用，为此化合物的生物活性提供新的理论基础，为预防和治疗动脉粥样硬化提供新的先导化合物。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂 HUVEC细胞株购自南京凯基生物工程有限公司。杜鹃素购自上海纯优生物科技有限公司，纯度>95%；RPMI-1640培养基、二甲基亚砜、胰蛋白酶-EDTA消化液、MTT、Hoechst 33258、多聚甲醛、H2O2，购自北京索莱宝生物科技有限公司；胎牛血清购自博世德生物有限公司。

1.2 仪器 二氧化碳培养箱(Heal Force HP90，上海力申科学仪器有限公司)；TD5A-WS台式低速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；光学倒置显微镜(OPTEC BDS200-PH，重庆奥特光学仪器有限责任公司)；荧光显微镜DFM-20(上海蔡康光学仪器厂)；全自动酶标仪(Model 680，MICROPLATE READER，Bio-Rad)。

2 方法

2.1 人脐静脉内皮细胞培养 采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养液培养细胞，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代培养，2～3 d换1次，细胞在5% CO2、37 ℃条件下培养。

2.2 MTT法检测杜鹃素细胞毒性，确定IC50值 待细胞生长至80%～90%密度时，将其按5×104/mL密度接种于96孔板中，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃孵育24 h；分别加入浓度为10、20、40、80 μg/mL的杜鹃素，作用细胞24 h，每组设6个平行孔，同时设立正常组分作为对照组；每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h；吸去孔内培养液，每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值(OD值)。

2.3 MTT法检测杜鹃素对H2O2诱导的HUVEC凋亡的保护作用[11]待细胞生长至80%～90%密度时，将其按5×104/mL密度接种于96孔板中，每孔100 μL，5% CO2、37 ℃孵育24 h；分别加入浓度为5、10、20 μg/mL的杜鹃素，作用细胞1 h，每组设6个平行孔，然后500 μM H2O2作用细胞1 h；每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h；吸去孔内培养液，每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。

2.4 Hoechst 33258染色法观察给药前后细胞形态学改变 待细胞生长至80%～90%密度时，将其按5×104/mL孔接种于6孔板，5% CO2、37℃孵育24 h；分别加入浓度为5、10、20 μg/mL的杜鹃素作用细胞1 h，每组设3个平行孔，然后500 μM H2O2作用细胞1 h；加入Hoechst 33258溶液，使其终浓度为1 mg/mL，4 ℃作用10 min；PBS洗1次，多聚甲醛固定20 min，荧光显微镜观察形态变化。

2.5 统计学分析 采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，率的比较采用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 MTT法测定杜鹃素细胞毒性 按log IC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]计算杜鹃素对细胞抑制作用的IC50值，得出IC50=45.2 μg/mL。

3.2 不同浓度杜鹃素对H2O2损伤血管内皮细胞凋亡的保护作用 在H2O2浓度相同的条件下，细胞的存活率随杜鹃素浓度的升高而提高。10、20 μg/mL的杜鹃素对H2O2诱导HUVEC凋亡的保护作用差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 杜鹃素对H2O2诱导HUVEC细胞存活率的影响(n=3)

3.3 不同浓度杜鹃素对H2O2损伤血管内皮细胞形态学影响 见图1、图2。图中显示，对照组的细胞数目较多，生长状态良好，细胞呈多角形或短梭形、饱满、大小一致；模型组的细胞皱缩变圆，间隙增大；与模型组相比，杜鹃素各剂量组细胞的形态均得到不同程度的改善，随着浓度的提高，细胞皱缩明显减少，大部分细胞饱满呈多角形或短梭形。

图1 杜鹃素对H2O2诱导HUVEC凋亡保护作用的细胞形态

图2 杜鹃素对H2O2诱导HUVEC凋亡保护作用的Hoechst 33258染色

4 讨论

血管内皮细胞凋亡与动脉粥样硬化的发生发展密切相关，活性氧自由基是内皮细胞损伤的主要原因之一[12]。H2O2是机体产生的活性氧，在过氧化条件下能分解成氧自由基，通过对生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，最终形成动脉粥样硬化斑块。据此本研究建立了以H2O2为刺激因素的内皮细胞氧化损伤模型，研究了杜鹃素对H2O2损伤的HUVEC的作用。在内皮细胞被H2O2损伤后，给予不同浓度的杜鹃素进行保护，MTT法结果表明，不同浓度杜鹃素使损伤HUVEC细胞的存活率显著提高，且具有剂量相关性。

近年研究表明，血管内皮细胞功能损害是心血管疾病早期的重要特征，是促进动脉粥样硬化最重要的始动因素[13]，因而寻找抗内皮细胞凋亡和保护内皮细胞功能的药物是防治心血管疾病的重要思路。本实验就杜鹃素对H2O2诱导HUVEC凋亡的保护作用进行了初步研究，结果显示，杜鹃素对H2O2诱导HUVEC的损伤具有一定的保护作用，为临床用药提供理论支持，但具体作用机制还需进一步研究。

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Study on protective effect of farrerol on H2O2-induced HUVEC apoptosis

LU Lei1,JIANG Ai-wen1,DU Pei-shan2,BAN Xu-xia1,LIU Yun-ning1,LIANG Jiang1

(1.Department of Pharmacy,The First Affiliated Hospital of Hebei North University,Zhangjiakou 075000,China;2.The First Hospital of Zhangjiakou,Zhangjiakou 075000,China)

Objective To study the protective effect of farrerol on H2O2-induced HUVEC apoptosis.Methods The cell activity was analyzed by MTT assay and morphological changes were observed with phase contrast microscopy and fluorescence microscopy.Results The endothelial cell were treated by 5,10,20 μg/mL of farrerol,after that,the cells’ activity increased in a dose-dependent manner,and the survival rate increased.Compared with H2O2group,the shrinkage of cell in farrerol+ H2O2group reduced significantly.Farrerol 20 μg/mL inhibited the HUVEC apoptosis induced by H2O2.Conclusion Farrerol has potential protective effect on H2O2-induced HUVEC apoptosis.

Farrerol;HUVEC;Apoptosis

2014-06-19

1.河北北方学院附属第一医院药剂科，河北 张家口 075000；2.张家口市第一医院，河北 张家口 075000

10.14053/j.cnki.ppcr.201502001