周 勇赵 玮张 君

麻杏二三汤对哮喘小鼠气道黏蛋白5ac mRNA影响的实验研究

周 勇1赵 玮2张 君3

目的 观察麻杏二三汤对哮喘小鼠肺组织气道黏蛋白（MUC）5ac mRNA的影响，探讨其抑制哮喘小鼠气道黏液高分泌的作用机制。方法 雌性BALB/c小鼠60只，随机分成空白对照组、哮喘模型组、强的松组及麻杏二三汤高、中、低剂量组，每组10只。除空白对照组，另五组以腹腔注射0.1%卵白蛋白（OVA）与10%氢氧化铝混悬溶液致敏，以1%OVA雾化液雾化攻击制作哮喘小鼠模型。分别给予生理盐水、生理盐水、强的松（10.0mg/kg）、麻杏二三汤高剂量（30g/kg）、中剂量（15g/ kg）、低剂量（7.5g/kg）灌胃，R－T PCR测定各组MUC5ac mRNA表达。结果 麻杏二三汤高、中、低剂量组MUC5ac mRNA荧光定量△Ct值分别为（12.80±0.84）、（12.15±0.49）、（11.41±1.49），均高于哮喘模型组的（9.82±0.84）（P＜0.01）。结论 麻杏二三汤能够有效抑制哮喘小鼠气道黏液高分泌，其机制可能与其下调支气管肺组织中MUC5ac mRNA表达有关。

小鼠；哮喘；MUC 5ac mRNA；麻杏二三汤

研究发现，哮喘发作时气道产生大量黏液，由于黏滞性较高较难被清除，与气道痉挛协同引起气道阻塞、气流受限。致命性哮喘几乎都有痰栓引起的气道闭塞[1]。而气道黏蛋白是决定哮喘气道黏液量和黏滞性的内在因素。本实验通过观察麻杏二三汤对哮喘小鼠肺内MUC5ac mRNA表达的影响，探讨麻杏二三汤抑制哮喘气道黏液高分泌的作用机制。

1 实验材料

1.1 动 物 BALB/c小鼠60只，体质量18～22g，雌性，上海西普尔－必凯实验动物有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2013－0016。

1.2 药物及试剂 麻杏二三汤（炙麻黄6g，杏仁、半夏各10g，化橘红12g，茯苓15g，炒苏子、莱菔子各10g，诃子、平地木各6g，白芥子、甘草各5g，购自杭州市红十字会医院中药房，由浙江省中医院制剂室水煎浓缩至生药1g/mL；强的松片（浙江仙居制药股份有限公司，生产批号101107）；卵白蛋白（Sigma公司）；dNTP（TaKaRa公司，LOT:D4030A CBF49018）；loxbuffer（TaKaRa公司，LOT：A11101A）；rTaq（TaKaRa公司，LOT：DR100AM CK1201CB）；Marker（Tiangen公司，LOT：MD101 F5110）；Trizol（BioBasic Inc公司，LOT:BS409 40950732）；酚氯仿（Biotech公司，LOT：PD0419－1 0326S09）；逆转录酶（TaKaRa公司，LOT：D2640A CK101D）；Oligo clcTn8（TaKaRa公司，LOT：D511 CT401A）；SYBR Premix Ex Taq试剂盒（TaKaRa公司，LOT：DRR041A）。

1.3 主要仪器 定量PCR仪器：iQTM5多重实时荧光定量PCR仪（美国Bio－Rad公司）；台式高速冷冻离心机（Eppendorf公司，型号Certrifuge5417R）；台式低速离心机（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，型号LX－300）；电动玻璃匀浆机（宁波新芝生物科技股份有限公司，型号DY89－Ⅱ）；电泳系统（Bio－RAD公司，型号Mini－Proten Tetra System）；凝胶成像仪（Bio－RAD公司，型号ChemiDoc XRS+System）。

2 实验方法

2.1 模型建立 实验组小鼠分别于实验第0天及14天腹腔注射新鲜配制的0.1%卵白蛋白（OVA）与10%氢氧化铝混悬溶液0.2mL（OVA 0.1mL+氢氧化铝0.1mL）致敏，空白对照组予等量生理盐水腹腔注射。实验第21、22、23天将实验组小鼠置于透明密闭箱中，以1%OVA雾化液按最大雾化量超声雾化，小鼠自然吸入30min，每天1次，共3天；同时空白对照组相应予等量生理盐水雾化。

2.2 分组及给药 雌性BALB/c小鼠60只，按照完全随机分组法分成空白对照组、哮喘模型组、强的松组及麻杏二三汤高、中、低剂量组，每组10只。于实验第14天起开始分别给予生理盐水、生理盐水、强的松（10mg/kg）、麻杏二三汤（30g/kg）、麻杏二三汤（15g/kg）、麻杏二三汤（7.5g/kg），每天1次，连续给药10天，从第21天始在激发前1h左右灌胃。

2.3 标本采集和制备 末次激发24h后腹腔注射1%戊巴比妥钠0.2mL麻醉，开胸取肺，肺组织先放入液氮,后置于－80℃冰箱保存备用。

2.4 荧光定量PCR法测定各组小鼠肺组织中MUC5ac mRNA

2.4.1 引物设计 采用Primer 5.0和Beacon designer 7.8软件进行定量PCR引物的设计，Mouse MUC5ac，基因序列号L42292.1，上游引物5'－GAGAGGAGGG TTTGATCTGTTTGA－3'，下游引物5'－GTGTGGTAAC TGAAGCTGTGGAA－3'，扩展长度120bp；Mouse 18S（内参），基因序列号NR_003278，上游引物5'－CGGACACGGACAGGATTGACA－3'，下游引物5'－CCAGACAAATCGCTCCACCAACTA－3'，扩展长度94bp。均由上海生物工程有限公司负责合成。

2.4.2 RNA提取操作步骤 ①样品处理：取出标本，液氮研磨，取50～80mg粉末加入1mL TRIzol混匀，室温放置5min；②加入氯仿0.2mL，用力振摇，室温放置2～3min；③最大转速12 000g离心15min，吸取上层水相，移置另一离心管；④加入0.5mL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；⑤4℃最大转速12 000g离心10min，弃上清；⑥加入75%乙醇1mL，充分洗涤沉淀后于4℃、10 000g离心5min，弃上清，室温干燥；⑦加入30～50μL RNase－Free Water，充分溶解后，加入DNase I进行消化，去除基因组DNA污染，分光光度计测定含量和纯度。⑧RNA纯度及浓度检测：抽提总RNA经琼脂糖凝胶电泳以鉴定见图，可见5s、18s和28s三条带，说明RNA完整没有降解，可作为逆转录反应的模板。取RNA抽提液2μL加98μL无RNA酶去离子水混匀，Du－640紫外分光光度仪测OD260/OD280，比值在1.8～2.0，检测核酸浓度，计算核酸量。

2.4.3 cDNA合成操作步骤（可参考TAKARA RT试剂盒） ①短暂离心后，加入如下组分：5×第一链反应缓冲液 2μL、Oligo dT引物 0.5μL逆转录酶0.5μL，总RNA 2μL，采用DEPC水补齐到10μL；②轻轻混匀后，混合物在37℃中放置20min；③85℃加热15sec终止反应，至冰上进行后续试验或冷冻保存。

2.4.4 PCR反应步骤 PCR反应体系：反应体系（25μL）：SYBR Premix Ex TaqTM（2×）12.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板2μL，ddH2O补充体积至25μL。PCR反应条件：95℃，1min；40个循环：95℃，10sec；64℃，25sec（收集荧光）；熔点曲线分析55℃to 95℃。

2.5 统计学方法 各个目的基因的表达水平以相对表达量△Ct进行分析。应用SPSS19.0软件进行统计分析。各组数据采用均数±标准差（±s）表示，计量资料比较用单因素方差分析（one－way ANOVA），以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 目的基因及内参电泳图 实验结果显示电泳条带和设计的扩增条带长度全部符合，见图1。

图1 PCR产物电泳图

3.2 荧光PCR扩增效果 各个引物扩增均具有单一的熔点曲线图，说明这些引物的荧光定量PCR扩增具有较强的特异性。见图2～5。

图3 Mouse 18s熔点曲线

图4 Mouse MUC5ac扩增曲线

图5 Mouse MUC5ac熔点曲线

3.3 Real－time定量PCR分析 对基因的表达水平以相对表达量△Ct值进行分析（ΔCt=C目的－Ct内参）。哮喘模型组、强的松组、麻杏二三汤高、中、低剂量组MouseMUC5ac的△Ct值均低于空白对照组（P均＜0.01）；强的松组、麻杏二三汤高、中、低剂量组均高于哮喘模型组（P均＜0.01）；麻杏二三汤高剂量组高于麻杏二三汤低剂量组（P＜0.01）；麻杏二三汤中、低剂量组低于强的松组（P＜0.01）。见表1。

4 讨论

气道黏液高分泌是哮喘气道重要的病理生理改变，也是导致哮喘高发病率和致死率的重要因素之一[2]。气道黏液中含有大约2%的黏蛋白，黏蛋白是气道黏液最主要的有形成分[3]，是一类由杯状细胞和粘膜下腺体合成的高度糖基化的蛋白质[4]，是决定黏液黏弹性和黏性的主要因素[5]。哮喘中气道黏液过度分泌，该特征与黏蛋白基因的异常表达有关[6]。气道黏蛋白分泌增加的直接后果是气道内黏液增加以及黏液性状的改变，导致气道狭窄加重、呼气时细支气管早期闭合以及气道纤毛清除功能障碍[7]。目前已有21种黏蛋白在人类基因组中被识别[8]，根据结构的不同分为膜结合型和分泌型。肺内表达的黏蛋白有膜结合型MUC1、MUC3、MUC4、MUC11，分泌型MUC2、MUC5ac、MUC5b、MUC6b、MUC7b、MUC8b等。其中MUC5ac、5B是气道内主要的分泌型黏蛋白。在气道表达的9种MUC中，MUC5ac是最主要的使气道黏液凝胶性增强的MUC[3]。Groneberg等[9]研究发现,致命性哮喘中MUC5ac、MUC5b的染色均加重，以MUC5ac染色为主。因此我们可以把MUC5ac作为哮喘气道黏蛋白基因表达情况的研究对象。MUC5ac的变化最能有效的反映气道黏液黏滞性的变化。

表1 各组大鼠肺组织MUC5ac mRNA荧光定量ΔCt值比较（±s）

表1 各组大鼠肺组织MUC5ac mRNA荧光定量ΔCt值比较（±s）

注：与空白对照组比较，▲P＜0.01；与哮喘模型组比较，△P＜0.01；与麻杏二三汤低剂量组比较，*P＜0.01；与强的松组比较，■P＜0.01

组别空白对照组哮喘模型组强的松组麻杏二三汤高剂量组麻杏二三汤中剂量组麻杏二三汤低剂量组只数10 10 10 10 10 10 ΔCT值16.53±0.86 9.82±0.84▲13.45±0.81▲△12.80±0.84▲△* 12.15±0.49▲△■11.41±1.49▲△■

麻杏二三汤各剂量组MUC5ac mRNA表达较哮喘模型组减少，气道黏液减少，抑制黏液高分泌。朱丹溪说：“哮喘专主于痰。”痰的产生主要在于脏腑阴阳失调，素体偏盛偏虚，对津液的运化失常，肺不能布散津液，脾不能输化水精，肾不能蒸化水液，而致凝聚成痰，如伏藏于肺，则成为发病的潜在“夙根”。痰饮既为哮喘的内因，又是推进哮喘发作、加重哮喘症状的病理因素。中医认为，痰饮是津液代谢障碍的产物。麻杏二三汤是名老中医焦树德治疗哮喘经验方，方中白芥子温肺化痰，利气散结；炒苏子降气化痰，止咳平喘；莱菔子消食导滞，下气祛痰；诃子敛肺止咳，降火利咽；平地木化痰止咳，利湿，共奏化痰止咳，降气平喘，理气和胃之功。半夏辛温性燥，能燥湿化痰，和胃降逆；化橘红理气行滞，燥湿化痰，两者相辅相成，增强燥湿化痰之力，又能理气和胃。麻黄辛温，解表散邪，宣肺平喘；杏仁味苦，降气平喘，化痰止咳，与麻黄一宣一降，调理肺气。全方合用共奏宣降肺气、健脾助运化痰逐饮、止咳平喘之功，契合哮喘痰气交阻的病机。临床报道其治疗哮喘、喘证取得较好疗效[10-11]，明显改善患者咳嗽、咳痰、喘息症状，提高患者生活质量。本组结果显示，麻杏二三汤能够抑制哮喘小鼠气道黏液高分泌的机制可能与下调MUC5ac mRNA表达相关。

［1］张丽.气道黏液高分泌疾病概述［J］.黑龙江医学，2009，33（2）：105-108.

［2］Evans CM，Koo JS.Airway mucus：The good，the bad，the sticky［J］.Pharmacol Ther，2009，121（3）：332-348.

［3］Leikauf GD，Borchers MT，Prows DR，et al.Mucin apoprotein expression in COPD［J］.Chest，2002，121（5suppl）：166S-182S.

［4］Paul E，Lee DI，Hyun SW，et al.Identification and characterization of high molecular-mass mucin-like glycoproteins in the plasma membrane of airway epithelial cells［J］.Am J Respir Cell MolBiol，1998，（19）：681-690.

Effect of Maxing Ersan Decoction on Pulmonary Mucin MUC5ac mRNA Expression in Asthmatic Mice

ZHOU Yong1,ZHAO Wei2,ZHANG Jun3. 1 Department of Preventive Medicine,Hangzhou Red Cross Hospital, Hangzhou (310003),China;2 Pulmonary Function Testing Room,the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China;3.Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

Objective To investigate the influence of Maxing Ersan decoction on the expression of pulmonary mucin MUC5ac in asthmatic mice.Methods Sixty female BALB/c mice were randomly divided into 6 groups: blank control group,asthma model group,prednisone－treating group,and Maxing Ersan decoction groups（high－, middle－,and low－dose）,with 10 mice in each group.A fresh mixture of 0.1%ovalbumin（OVA）and 10%aluminum hydroxide suspension solution was intraperitoneally injected to sensitize and 1%OVA atomized liquid was used to induce asthma in 5 groups except blank control group.Mice in the corresponding group were given normal saline,normal saline,prednisone（10.0mg/kg）,Maxing Ersan decoction（7.5g/kg）,Maxing Ersan decoction（15g/kg）, Maxing Ersan decoction（30g/kg）by gavage.Real－time fluorescence quantitative polymerase chain reaction assay（RT－PCR）was used to detect the expression of MUC5ac mRNA in mice'lung tissue of each group.Results TheΔCt value of all Maxing Ersan decoction groups（12.80±0.84,12.15±0.49,11.41±1.49）were higher than that of asthma model group（9.82±0.84,P＜0.01).Conclusion Maxing Ersan decoction can effectively inhibit the asthmatic mice'airway mucus hypersecretion by downregulating the expression of MUC5ac mRNA.

mice；asthma；MUC5ac mRNA；Maxing Ersan decoction

浙江省中医药科技计划项目（No.2010ZA096）

1杭州市红十字会医院干部保健科（杭州 310003）；2浙江中医药大学附属第一医院肺功能室（杭州 310006）；3浙江中医药大学（杭州 310053）

周勇，Tel：13216701315；E－mail：zhouyong_1976@163.com