王 海周 蕾许丹丹

·经验交流·

肝硬化患者网织血小板与血小板参数之间的相关性及临床意义

王 海1周 蕾2许丹丹1

肝硬化；网织血小板；血小板；大血小板比率

网织血小板（reticulated platelets，RP）是骨髓巨核细胞近期释放入外周血的未成熟细胞[1]，仅含少量的粗面内质网和mRNA，不含DNA或核的成分，因此具有合成少量蛋白质的能力，其代表血循环中最年轻的血小板。与正常血小板相比较，RP的体积大，胞浆内含有少量mRNA，具有更强的活性[2]；因此测定外周血RP可以比较精确地反映骨髓血小板生成情况[3]。血小板的平均体积（MPV）代表单个血小板的平均体积，常用来评价骨髓功能；血小板分布宽度（PDW）是反映血小板体积大小是否均匀的参数，PLCR反映大血小板比率。有文献[4]报道，血小板参数与体外血小板功能有较好的相关性，可间接反映血小板功能状况。本研究通过对肝硬化患者和慢性肝炎患者外周血中网织血小板与血小板参数进行测定，以揭示肝硬化患者血小板变化的原因，并对网织血小板百分比（RP%）与血常规血小板参数（PLT、MPV、PDW及P－LCR）的相关关系进行探讨。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集浙江省立同德医院2013年4月健康体检者20名为对照组，其中男9名，女11名，年龄20岁～62岁，血小板计数（100～300）×109/L。2013年1～4月住院诊断明确的慢性肝炎患者42例为慢性肝炎组，其中轻度18例，中度15例，重度9例；男23例，女19例，年龄18～65岁。同期住院诊断明确的肝硬化患者30例为肝硬化组，男18例，女12例，年龄36～72岁。

1.2 诊断标准 入选慢性肝炎组和肝硬化组的患者的诊断均符合2000年西安全国肝炎会议《病毒性肝炎防治方案》的诊断标准[5]；均经血清学检查排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒感染。

1.3 仪器与试剂 RP测定采用美国BeckmanCoulter公司Epics XL型流式细胞仪，应用SYSTEMⅡSoftware获取和分析试验数据，噻唑橙（TO）和CD 41b单抗（PE标记）购自苏州联科公司。PLT计数及MPV及PDW、P－LCR的测定采用Sysmex XE－1200型全自动血细胞分析仪及原厂配套试剂（日本Sysmex公司）。

1.4 方 法

1.4.1 标本采集 符合上述要求的个体，均在治疗前采集5mL静脉血，2mL注入乙二胺四乙酸二钾（EDTA－K2）抗凝的真空采血管，充分混匀，立即在血球计数仪上测定PLT、MPV、PDW、P－LCR。将同一份标本500r/min离心5min，分离出上清，加入TES，离心（2000r/min，10min），然后弃上清，制成富含血小板的血浆（RPR）。取两支FCM专用试管，都加入20μL PRP，50μLPBS和10μL CD41－PE单抗，混匀后室温避光孵育20min；一支加入1mL PBS作为对照管，另一支加入1mL浓度为20μg/L的TO试剂作为测定管，室温孵育30min后上流式细胞仪进行测定。剩余的3mL注入无抗凝剂的真空采血管，2h内离心（3000r/min，10min）分离非溶血的血清，行生化项目检测。

1.4.2 标本测定 用Sysmex XE－1200血细胞分析仪及原厂配套试剂（日本Sysmex公司）测定PLT、MPV、PDW、P－LCR。用美国Beckman Coulter公司Epics XL型流式细胞仪检测RP占PLT的百分比（RP%），RP绝对值为血小板总数乘以RP%。参考Matic等[6]描述的设门策略，检测对照管和测定管，使对照管中99%的血小板位于阴性区来确定阳性阈值，共检测20 000个血小板，识别标本TO阳性的RP百分比，以RP%表示。

1.5 统计学方法 应用SPSS16.0软件进行统计分析，对于符合正态性分布的数据以（±s）表示，三组均数比较F检验，两组间比较采用t检验；相关性检验用Pearson直线相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的临床特征及实验室检查分析 记录各组的临床特征，并检测各组血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、白蛋白（Alb）、总胆红素（TB），并计算白球比（A/G）。对慢性肝炎组、肝硬化组和对照组三组之间进行单因素方差分析，各组间年龄差异无统计学意义（P＞0.05），而各组之间血清ALT、AST、Alb、TB水平以及A/G比值比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。见表1。

2.2 各组PLT、MPV、PDW、P－LCR及RP%和RP绝对值结果分析 检测慢性肝炎组、肝硬化组和对照组PLT、MPV、PDW、P－LCR及RP%和RP绝对值，对三组之间进行单因素方差分析，结果显示三组间PLT、MPV、PDW、P－LCR及RP%和RP绝对值差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组比较，慢性肝炎组PLT降低，MPV、PDW、P－LCR升高（t=－2.51，3.09，4.09，3.61，P＜0.05），肝硬化组PLT、RP%、RP绝对值降低，P－LCR升高（t=－6.13，－6.31，－7.54，2.56，P＜0.05）；与慢性肝炎组比较，肝硬化组PLT、RP%、RP绝对值降低（t=－3.45，－4.04，－4.72，P＜0.05）。见表2。

2.3 三组RP%和PLT、MPV、PDW、P－LCR相关性分析 对三组RP%与PLT之间进行相关分析，结果三组RP%与PLT之间均无相关关系（r=－0.062，－0.049，－0.037，P＞0.05）；三组RP%与MPV、PDW、P－LCR之间呈相关关系（P＜0.01）。见表3。

3 讨论

肝硬化患者多伴有血小板变化，这种变化既有血小板功能的改变，又有血小板数量的变化。多年来，人们一直认为肝硬化血小板减少的原因是由于脾功能亢进；然而,一些行脾切除术或TIPS降门静脉压力患者的血小板也会持续低于正常标准，因此，脾亢并不能完全解释肝硬化患者血小板减少的机制[7]。

外周血RP水平被认为是反映体内血小板生成能力的指标，通过测定外周血中RP的数量和RP%可以有效的鉴别血小板降低的原因；而PLT、MPV、PDW、P－LCR是反应血小板功能的参数；MPV反映血小板体积大小，可用于血小板减少原因的鉴别。若血小板破坏增多而引起血小板减少时，MPV增大；若骨髓受损导致血小板减少时，MPV减小。另外血栓前状态，MPV常增大，特别在血小板聚集期，并随其聚集速率和程度增加而MPV增加[8]。PDW升高说明血小板大小不一，通常MPV增大，PDW也增大；P－LCR升高，提示血小板代谢活跃，黏附力与聚集力相对较强大。RP%和PLT、MPV、PDW、P－LCR同时检测，有助于了解慢性肝病患者血小板变化的原因。本研究发现，与正常对照组比较，慢性肝炎患者RP%略高于正常对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；RP绝对计数值略低于正常对照组，但差异无统计学意义；而MPV、PDW、P－LCR显著升高（P＜0.05）；这与岳彩娟等[9]报道一致。说明慢性肝炎患者并无血小板生成障碍，而导致血小板降低的原因可能性是破坏过多，一般认为与脾脏的吞噬、血小板相关抗体的存在等有关。也有研究认为，血小板相关免疫球蛋白介导的破坏也可能是慢性肝炎患者血小板数目减少血小板减少的原因之一[10]。肝硬化患者RP绝对计数值和RP%均显著低于正常对照（P＜0.05），与Michur等[11]报道的结果基本一致；而肝硬化患者的MPV、PDW略高于正常对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05），PLCR显著升高（P＜0.05）；其原因可能主要有二：一是由门脉高压导致脾功能亢进而致血小板破坏增多，二是由于肝细胞受损而导致由肝细胞分泌的血小板生成素（TPO）减少[12]，则作用于巨核细胞的TPO的量也就越少，生成的网织血小板减少，血小板生成障碍所致[13]。有研究[14]表明，若血小板破坏增多而引起血小板减少时，MPV增大；若骨髓生成受损导致血小板减少时，MPV减小；这与本文所得慢性肝炎患者血小板降低与血小板破坏过多有关的结论是一致的。而肝硬化患者的MPV与正常对照组无显著性差异，可能是由于血小板破坏增多而引起血小板MPV增大和骨髓生成受损导致血小板MPV减小双重作用造成的结果。RP%与PLT之间无相关关系，而RP%与MPV、PDW、P－LCR之间均具有良好相关性。我们在RP%与PDW及P－LCR相关性分析显示，随着PDW及P－LCR增大，RP%同样出现上升趋势。血小板总数是检测外周血血小板浓度的参数，与RP%之间无相关关系。MPV与RP%均是反映骨髓血小板生成的指标，虽MPV与RP%之间呈正相关关系，但不存在一一对应关系；这可能由于MPV受小红细胞、红细胞碎片及大血小板的干扰较大，许多情况下不能反映血小板实际体积的大小。而检测RP%时采用TO/ anti CD41双标法，可以有效去除小细细胞、红细胞碎片及大血小板的干扰，使RP%能够更好地反映骨髓巨核细胞的生成状态。

表1 各组一般资料及临床特征比较（±s）

表1 各组一般资料及临床特征比较（±s）

组别对照组慢性肝炎组肝硬化组F值P值例数20 42 30年龄（岁）38.5±9.9 37.2±11.3 40.3±12.5 0.64 0.53 ALT（U/L）28.5±8.5 108.6±40.5 168.5±54.6 67.59 0.000 AST（U/L）23.4±8.8 89.8±43.5 152.6±53.5 55.78 0.000 Alb（g/L）44.6±4.7 39.0±7.8 30.8±9.8 19.12 0.000 A/G 1.4±0.2 1.3±0.3 0.9±0.2 31.04 0.000 TB（μmol/L）9.4±4.1 46.4±21.2 109.1±44.7 76.11 0.000

表2 各组PLT、MPV、PDW、P－LCR及RP%和RP绝对值比较（±s）

表2 各组PLT、MPV、PDW、P－LCR及RP%和RP绝对值比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与慢性肝炎组比较，△P＜0.05

RP 2.96±0.86 2.35±1.26 1.10±0.85*△21.05 0.000组别对照组慢性肝炎组肝硬化组F值P值例数20 42 30 PLT（×109/L）203.10±50.03 163.86±60.63* 18.33±46.40*△89.91 0.000 MPV（fL）9.63±0.98 10.56±1.16* 10.26±1.20 4.53 0.012 PDW 16.05±0.72 16.92±0.81* 16.58±1.73 3.84 0.025 P－LCR（%）17.33±5.49 24.80±8.42* 22.20±7.22* 6.74 0.001 RP% 2.15±0.45 2.59±1.83 1.19±0.58*△10.20 0.000

表3 各组RP%和PLT、MPV、PDW、P－LCR相关关系结果

总之，同时检测肝硬化患者外周血PLT、MPV、PDW、P－LCR、RP%可以更好揭示肝硬化患者血小板变化的原因，并且RP%较MPV可更为精确地反映骨髓血小板生成情况,值得临床推广应用。

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（收稿：2014－09－01 修回：2014－11－07）

浙江省公益技术应用研究项目（No.2013C37066）

1浙江省立同德医院检验科（杭州 310012）；2杭州市儿童医院检验科（杭州 310003）

王海，E－mail：wanghai.5188@163.com