陈涛 陈亮 李海成 郭卉欣 林东子 王威 李玉美 余丽 黎贞燕 孙琦 黄新春 李国周 周杰 赵梅桂 钟球 周琳



结核抗原诱导的人外周血细胞因子调控网络在结核病诊断中的价值

陈涛 陈亮 李海成 郭卉欣 林东子 王威 李玉美 余丽 黎贞燕 孙琦 黄新春 李国周 周杰 赵梅桂 钟球 周琳

目的 γ-干扰素(IFN-γ)释放试验(IGRA)是目前广泛运用的结核病筛查和诊断技术，但其无法区分活动性结核病和潜伏性结核感染(LTBI)。本研究旨在发现更加合适的血清标志物(细胞因子)可以替换IGRA，用于活动性结核病的诊断和LTBI者的筛查，以及这些细胞因子之间的相互调控网络关系。方法 40份健康人(简称“健康组”)血液样本，40份确诊为活动性肺结核患者(简称“肺结核组”)的血液样本，40份LTBI者(简称“LTBI组”)的血液样本；通过结核分枝杆菌特异性抗原[早期分泌抗原靶6(ESAT6)和培养滤液蛋白10(CFP10)]进行刺激；通过人细胞因子芯片对刺激后的细胞因子表达变化进行检测；并筛选显著变化的因子，进行细胞因子调控网络构建。结果 在肺结核组患者的外周血中嗜酸粒细胞趋化蛋白(CCL)1(I-309)、趋化因子CXCL9[又称为Mig,即monokine induced by IFN-γ(IFN-γ诱导的单核因子)]、白细胞介素(IL)10、IL6、集落刺激因子(CSF)2、CSF3、IL8、IL1α、IL7、转化生长因子(TGF)-β1、CCL2、 IL2、IL13、肿瘤坏死因子(TNF)α等因子在结核特异性抗原刺激后显著上调(2.06倍至3.18倍)；而在健康组和LTBI组当中却没有显著上调。在肺结核组和LTBI组患者的外周血中CCL3、IL1b、CCL8、IFN-γ、CXCL10因子在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后明显上调(2.44倍至11.56倍)；而在健康组中这些因子没有明显的上调。趋化因子CCL4和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α因子在健康组、LTBI组和肺结核组外周血中，经过结核分枝杆菌特异性抗原刺激后，表达都明显上调。细胞因子调控网络显示，这些表达上调的因子，主要集中于IFN-γ和IL1α因子调控网络中。结论 CXCL10(IP-10)、CCL3、CCL8和IL1β因子可能比IFN-γ更适合用于结核病或LTBI者的筛查。

结核, 肺/诊断； 细胞因子类； 抗原, 细菌； 细菌蛋白质类； 生物学标记

结核病依然是目前全球最为严重的传染性疾病，根据WHO 2014年全球结核病报告统计(Globaltuberculosisreport2014. WHO/HTM/TB/2014.08.)，全球结核分枝杆菌的感染人数达到了1/3，也就是有近20亿的潜伏结核感染(LTBI)者，其中大概有5%～10%会发展为活动性结核病。根据2014年中国CDC统计，2012年全国死于结核病的患者有25万例，是所有其他传染性疾病导致死亡例数的2倍。可见，结核病依然是威胁人类健康的重大问题，然而，我们目前还缺乏非常有效的控制方法。

对结核病的控制，最有效的办法就是早期诊断和提前干预[1]。目前对活动性结核病的诊断和LTBI者的筛查，临床常用的是γ-干扰素(IFN-γ)释放试验(interferon-gamma release assays，IGRA)。其原理是通过结核特异性抗原刺激外周血中的结核特异性T细胞释放γ-干扰素(IFN-γ)，来判断是否被结核分枝杆菌感染过。IGRA检测结核分枝杆菌感染，敏感度高，特异度好；但是，由于IFN-γ来源于活动性T细胞，也来源于静息T细胞，而且二者在受到结核特异性抗原刺激的时候，释放的干扰素水平相当，因此它不能区分LTBI和活动性结核病[2-3]。尤其在结核感染人数如此众多而发病率又不高的情况下，区分活动性结核病和LTBI是非常有必要的。因此，筛选新的活动性结核病标志物是非常重要的。

目前，对于结核新标志物的筛查，主要是采用细胞因子芯片对活动性结核病患者、LTBI者和健康人的血清直接进行差异分析[4-5]，或者是采用结核特异性抗原对活动性结核病患者、LTBI者或者健康人外周血进行刺激后，再采用芯片对外周血上清进行分析[6-13]；或者是提取活动性结核病患者、LTBI者、健康人外周血中的白细胞进行培养，并采用结核特异性抗原进行刺激，然后研究其分泌因子的差异[14]。所有的这些研究，由于采用的芯片的因子数量少而且各不相同，无法得出一致的结果。因此，需要一个更加系统的方法对所有的这些因子进行分析。

本研究采用结核特异性抗原对活动性肺结核患者、LTBI者和健康人的外周血进行刺激，然后通过高通量细胞因子芯片对刺激后外周血中细胞因子的表达变化进行检测，并结合已经报道的结核分枝杆菌潜在标志物，对所有的潜在标志物构建细胞因子调控网络，以期发现较IFN-γ更加合适的细胞因子，可以用于结核感染的快速诊断，以及对LTBI者和活动性结核病患者进行快速鉴别。

材料与方法

一、样本收集

本研究获得当地伦理委员会批准(广东省结核病控制中心)，并取得患者的书面知情同意。本研究共征集了120份外周血样，其中40份为健康人(简称“健康组”)对照血样，40份确诊为活动性肺结核患者(简称“肺结核组”)血样，40份确诊为LTBI者(简称“LTBI组”)血样。每份血样3 ml，并采用肝素钠进行抗凝处理。其中健康组40名，经影像学检查没有发现任何结核病征象，同时没有任何结核病的临床症状，以及IGRA检测结果为阴性。40例LTBI组成员的IGRA检测结果阳性，但是没有其他任何结核病临床症状。40例肺结核组患者在结核病专科医院确诊，诊断标准为：患者临床症状有咳痰、咯血；影像学检查发现肺部阴影；IGRA检测阳性，痰涂片检测阳性，部分样本痰培养阳性；同时经过标准的抗结核药物治疗，症状明显减轻，且经过6个月的抗结核药物治疗后，全部治愈，血液样本在初诊为结核病且在治疗之前收集。

二、血浆细胞因子芯片检测

商业化人细胞因子检测芯片(美国RayBiotech公司)被用于测定血浆样品中40种细胞因子的表达水平变化。芯片检测过程按照说明书要求进行：每张芯片先用100 μl封闭液室温封闭2 h后；加入100 μl 的血浆样品置于4 °C过夜孵育；采用磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗去未结合的样本；后加入100 μl生物素化的混合检测抗体室温孵育2 h；采用PBST洗去未结合的抗体；后加入100 μl的三甲川3H-吲哚菁染料(Cy3)标记的链霉亲和素室温反应1 h；采用PBST洗去未结合的Cy3标记的联袂亲和素后，采用Genepix4000B激光扫描仪(Axon公司, 美国)进行扫描，并获取每个点的信号值。

三、IGRA检测

结核分枝杆菌特异性细胞介导的免疫检测试剂(ELISA)购买自武汉海吉利生物制品有限公司。整个实验分析过程按照说明书要求进行。每份3 ml新鲜血样分成3等份，分别采用结核分枝杆菌特异性抗原[早期分泌抗原靶6(ESAT6)和培养滤液蛋白10(CFP10)]、磷酸盐缓冲液(PBS)(阴性对照)、外源凝集素(阳性对照)进行刺激。37 ℃水浴刺激20 h后，4000g离心10 min，收集血浆，IFN-γ定量检测试剂盒检测血浆中IFN-γ的水平。结果按照说明书要求采用表1所列标准进行判读。

表1 IGRA检测的判读标准

图1～4 细胞因子芯片分析外周血经过结核分枝杆菌抗原(ESAT6和CFP10)刺激后细胞因子的表达变化。图1示健康组标本经PBS 刺激后；图2示LTBI组标本经结核分枝杆菌抗原刺激后； 图3示健康组标本经结核分枝杆菌抗原刺激后；图4示肺结核组患者标本经结核分枝杆菌抗原刺激后

四、统计学分析

统计学分析采用SPSS 20.0统计软件进行。双尾Mann-Whitney检验用于细胞因子表达差异分析。P<0.05被认为差异具有统计学意义。差异表达细胞因子采用欧洲分子生物学实验室(EMBL)的String在线数据库进行细胞因子调控网络构建及分析。

结 果

一、IGRA无法区分活动性结核病和TLBI

为了筛查与结核相关的细胞因子，我们采用结核分枝杆菌特异性抗原对新鲜外周血进行刺激，然后采用高通量细胞因子芯片对血浆中的40个常见细胞因子浓度进行检测(图1～4)。以健康人血液经过PBS刺激为基准，分析不同组血液样本经过结核分枝杆菌特异性抗原刺激后每个细胞因子表达变化的情况(采用倍数表示)，以及差异有无统计学意义(图5)。图5显示，IFN-γ因子无论是在活动性结核病患者组或LTBI感染组，在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后都有明显的上调[分别是2.44倍(独立样本t检验，t=3.52，P=0.001)和2.16倍(独立样本t检验，t=3.045，P=0.001)]，而且二者上调倍数差异无统计学意义(独立样本t检验，t=3.43，P=0.231)。因此，IGRA无法用于区分活动性结核病和LTBI。健康人群组的血液标本经过结核分枝杆菌特异性抗原刺激后，IFN-γ也有轻微的上调[1.25倍(独立样本t检验，t=2.01，P<0.05)]。同时，与健康人结核分枝杆菌特异性抗原刺激比较，结核病组和LTBI组，IFNg上调的倍数明显要高，且差异具有统计学意义(独立样本t检验，t值分别为3.66、3.34，P值均为0.001)。

二、诊断活动性结核病的标志物

好的活动性结核病诊断指标，应该在结核病患者中经结核分枝杆菌特异性抗原刺激后显著上调，而在健康人群中和LTBI者中没有明显的变化。因此，笔者规定诊断活动性结核病的标志物必须满足以下条件：①(健康组+结核分枝杆菌特异性抗原刺激)检测结果/(健康组+PBS刺激)检测结果的比值<1.2；②(肺结核组+结核分枝杆菌特异性抗原刺激)检测结果/(健康组+PBS刺激)检测结果的比值>2；③(LTBI组+结核分枝杆菌特异性抗原刺激)检测结果/(健康组+PBS刺激)检测结果的比值<1.5。本研究发现：嗜酸粒细胞趋化蛋白(CCL)1(I-309)、趋化因子CXCL9[又称为Mig,即monokine inducedbyIFN-γ(IFN-γ诱导的单核因子)]、白细胞介素(IL)10、IL6、集落刺激因子(CSF)2、CSF3、IL8、IL1A、IL7、转化生长因子(TGF)-β1、CCL2、 IL2、IL13、肿瘤坏死因子(TNF)α等因子符合条件。上述细胞因子在各组加结核分枝杆菌特异性抗原刺激后检测的变化水平见表2。

IL：白细胞介素；CSF：集落刺激因子；CXCL：趋化因子；CCL：嗜酸粒细胞趋化蛋白；TGF：转化生长因子；TNF：肿瘤坏死因子；IFN：干扰素；PDGF：血小板源性生长因子；TIMP：金属蛋白酶组织抑制因子；MIP：巨噬细胞炎性蛋白；ICAM：细胞间黏附分子图5 细胞因子芯片分析外周血经过结核分枝杆菌抗原(ESAT6和CFP10)刺激后各个细胞因子的表达水平的差异

三、结核病筛查指标

好的结核病筛查指标，应该能够同时发现活动性结核病和LTBI。因此，理论上讲结核病筛查标志物应该在结核病患者和LTBI者的血液标本经结核分枝杆菌特异性抗原刺激后都明显上调，而在健康人应该没有明显的变化。因此，笔者规定结核病筛查标志物必须满足以下条件：①(健康组+结核分枝杆菌特异性抗原刺激)检测结果/(健康组+PBS刺激)检测结果的比值<1.2；②(肺结核组+结核分枝杆菌特异性抗原刺激)检测结果/(健康组+PBS刺激)检测结果的比值>2；③(LTBI组+结核分枝杆菌特异性抗原刺激)检测结果/(健康组+PBS刺激)检测结果的比值>2。本研究发现只有：CCL8、IFN-γ、CXCL10因子符合条件。CCL3和IL1b两个因子，虽然(健康组+结核分枝杆菌特异性抗原刺激)检测结果/(健康组+PBS刺激)检测结果的比值>1.2，但是“(肺结核组+结核分枝杆菌特异性抗原刺激)检测结果/(健康组+PBS刺激)检测结果的比值”和“(LTBI组+结核分枝杆菌特异性抗原刺激)检测结果/(健康组+PBS刺激)检测结果的比值”上调倍数都远远>2，所以，可能也是潜在的结核病筛查因子(表3)。

表2 诊断活动性结核病的潜在标志物(细胞因子)在各组加结核分枝杆菌特异性抗原刺激后检测的变化水平(比值)

表3 结核病筛查潜在标志物(细胞因子)在各组加结核分枝杆菌特异性抗原刺激后检测的变化水平(比值)

IL：白细胞介素；CSF：集落刺激因子；CXCL：趋化因子；CCL：嗜酸粒细胞趋化蛋白；TGF：转化生长因子；TNF：肿瘤坏死因子；IFN：干扰素；PDGFA：血小板源性生长因子A；TIMP：金属蛋白酶组织抑制因子；MIP：巨噬细胞炎性蛋白；ICAM：细胞间黏附分子图6 结核分枝杆菌特异性抗原诱导的细胞因子之间的相互调控网络

四、非特异性细胞因子

此外，笔者发现CCL4和巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α因子，无论是在健康组、肺结核组和LTBI组当中，受到外来结核分枝杆菌特异性抗原刺激的时候都会显著上调。因此，这2个因子可能是非特异性细胞因子。

五、结核分枝杆菌特异性抗原诱导的细胞因子之间的相互调控网络

一个好的标志物，应该是由结核分枝杆菌特异性效应T细胞受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后直接分泌的因子，而不是由巨噬细胞或其他非特异性T细胞受到抗原刺激后产生的因子，否则标志物的特异性不强。因此，笔者研究了这25个表达上调的细胞因子之间的相互调控网络关系(图6)。从图6中可以看到，上述细胞因子主要受IFN-γ、IL11、IL1a、IL7等4个细胞因子调控。IL1β、IL6、IL17a、IL2、SCF2、IL5等6个细胞因子处于调控网络的中游，可能起到放大的作用。而CXCL9、CXCL10(IP-10)、IL8、IL15、CCL2、CCL3处于上述25个细胞因子调控网络的下游阶段，可能直接发挥作用。而IL10 在这个调控网络中可能主要起到负调控的作用，其对多个细胞因子都起到负调节的作用，包括IL6、IL8、IL2、CSF2、CCL2、CSF3，而其自身主要又受到CSF3的促进调节。因此，IL10和CSF3之间可能通过这样的一种相互调控，达到一种平衡。此外，还有TGF-β1，CCL4、CCL8、血小板源性生长因子B(PDGFB)、骨细胞生长营养素(osteocyte growth nutritive，OGN)等细胞因子独立于这25个细胞因子调控网络之外。他们有可能是由T、B或巨噬细胞受到抗原刺激后直接分泌的。

讨 论

活动性结核病的诊断和LTBI筛查的标志物人们一直在研究，却没有新的突破。笔者采用高通量细胞因子芯片，将结核分枝杆菌特异性抗原(ESAT6 和CFP10)对肺结核组、LTBI组和健康组的外周血进行刺激后，检测血清中的相关细胞因子，并对这些表达受到调控的细胞因子进行调控网络的构建，发现了一些可以用于活动性结核病诊断和LTBI进行大规模筛查的新标志物。

一、适宜结核感染筛查的细胞因子

本研究发现，在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后，IFN-γ在肺结核组和LTBI组中都显著上调，但上调程度差异无统计学意义，因此无法用于活动性结核病和LTBI的鉴别，这与前人的研究结果相符合[3]。同时笔者发现，IP-10因子和IFN-γ一样，在肺结核组和LTBI组中的表达都上调，而且IP-10在LTBI组中上调的倍数比在肺结核组中上调得更明显，因此IP-10也只适合于LTBI的筛查，而不是活动性结核病的诊断，这与以前的研究一致[15-16]。从细胞因子的调控网络可以看出，IP-10其实也是处于IFN-γ因子的调控下，故其与IFN-γ有着相同的表现并不奇怪。不过IP-10较IFN-γ在血清中的浓度要高出很多，更容易检测，而且刺激后的变化更明显；因此，IP-10 可能可以取代IFN-γ用于LTBI的筛查。此外，在本研究中还发现：CCL8[单核细胞趋化蛋白2(MCP2)]、IL1b、CCL3(MIP-1α)3个因子，同样在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后，在肺结核组和LTBI组中明显上调。IL1b已经有报道在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后显著上调[17]，从图6可以看出IL1b也受IFN-γ调控。而笔者首次发现MCP2和MIP-1α两个因子在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后上调非常显著，尤其是MCP2，在健康人中，几乎没有变化，而在活动性结核病患者和LTBI者中有着2.5倍的上调。因此，也可以用于结核感染的筛查。

二、可用于活动性结核病诊断的细胞因子

本研究发现CCL1(I-309)、CXCL9(MIG)、IL10、IL6、CSF2、CSF3、IL8、IL1a、IL7、TGF-β1、CCL2、 IL2、IL13、TNFα因子在活动性结核病患者中的表达变化明显。其中部分因子在前人的研究中已经有过报道，比如I-309 因子在以前的报道中都已经证实在树突细胞经过结核分枝杆菌特异性抗原刺激会上调[18-19]，CXCL9(MIG)[20]、IL10[21]、IL6[22]、IL7、IL8[23-26]、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)[27]在相应的文章中都已有报道。其中IL10是个抗炎症因子，在免疫调控中主要起到逆调控因子作用[28]，从图6可以看出，IL10处在CSF2和CSF3的调控下，因此，其有可能是一个非特异性因子，在感染中起到维持免疫反应不适于过强。因此，可能不是一个结核病诊断的特异性指标。IL10可能通过与CSF3和CSF2的相互调控达到平衡。IL6、IL2处于网络的中间层，主要受到IFN-γ和IL1a、IL11和IL17的调控，同时又调节其他因子的表达；因此，IL6、IL2可能起到中间放大作用，同样可能也是非特异性的因子。TNFα调控网络，独立于这个调控网络之外。同样已经有研究证实，TNFα在结核分枝杆菌特异性抗原刺激后上调[29]。TGF-β2已经有研究证明，其在结核分枝杆菌刺激后上调[29-30]；从图6中看，其独立于IFN-γ信号通路，因此可能有自己的调控网络，这需要更多的后续研究来证实。IFN-γ、IL1a、IL7、IL11虽然都处于整个调控网络的上游，但是IFN-γ在LTBI者和活动性结核病患者中表达都上调，只有IL1a、IL7、IL11却在活动性结核病患者中表达上调。因此，这可能是活动性结核病区分于LTBI的调控网络；应该增加对这些因子的研究，通过多因子联合检测来区分活动性结核病和LTBI。但是，从细胞因子相互调控的网络上讲，IL1a、IL7可能更具有诊断价值，因为均处于网络的上游，可能是由结核分枝杆菌特异性抗原刺激结核分枝杆菌特异性效应T细胞而表达的。当然，对于IL1a和IL7的细胞表达来源还要做进一步的研究，在诊断的敏感度和特异度上还有待更大样本的验证。

图6还可以看到，IFN-γ在这个调控网络中是一个很重要的细胞因子，很多的因子都在其调控的下游，包括CXCL9、CXCL10、IL1B、IL6、IL15。IFN-γ很可能是结核分枝杆菌特异性效应T细胞受到结核分枝杆菌特异性抗原刺激后分泌的特异性因子，因此，是一个很好的特异性标志物。同样IL1A、IL7也是。CXCL10也就是IP-10 因子，虽然在很多文献中都报道其与LTBI有着非常密切的关联[31-32]，可能可以作为LTBI筛查的标志物，但是它也是处于IFN-γ的调控下。

本研究从细胞调控网络揭示了各个因子之间的相互调控作用，并发现了一些新的标志物有可能用于LTBI的筛查和活动性结核病患者的诊断。尤其是多个指标的联合运用可提高敏感度和特异度。但是，本研究还存在一些缺陷，首先样本量不足。同时，研究指标不足，笔者只研究了其中40个炎症因子的表达变化；为了得到更加完整的调控网络，还需要研究更多的与免疫相关的因子，这也将是以后研究的一个重要方向。

[1] Abouda M, Yangui F, Triki M, et al. Tuberculosis prevention. Article in French. Rev Pneumol Clin, 2015,71(2/3):159-167.

[2] Dheda K, van Zyl Smit R, Badri M, et al. T-cell interferon-gamma release assays for the rapid immunodiagnosis of tuberculosis: clinical utility in high-burden vs. low-burden settings. Curr Opin Pulm Med, 2009,15(3): 188-200.

[3] Wagner D, Hörster R, Lange B, et al. Evaluation of T-cell interferon-gamma-release assays for the diagnosis of latent and active tuberculosis. Article in German. Dtsch Med Wochenschr, 2008,133(8): 354-357.

[4] Liu J, Jiang T, Wei L, et al. The discovery and identification of a candidate proteomic biomarker of active tuberculosis. BMC Infect Dis, 2013,13: 506.

[5] Weiner J 3rd, Parida SK, Maertzdorf J, et al. Biomarkers of inflammation, immunosuppression and stress with active di-sease are revealed by metabolomic profiling of tuberculosis patients. PLoS One, 2012,7(7): e40221.

[6] Armand M, Chhor V, de Lauzanne A, et al. Cytokine responses to quantiferon peptides in pediatric tuberculosis: a pilot study. J Infect, 2014,68(1): 62-70.

[7] Anbarasu D, Raja CP, Raja A. Multiplex analysis of cytokines/chemokines as biomarkers that differentiate healthy contacts from tuberculosis patients in high endemic settings. Cytokine, 2013, 61(3): 747-754.

[8] Borgström E, Andersen P, Atterfelt F, et al. Immune responses to ESAT-6 and CFP-10 by FASCIA and multiplex techno-logy for diagnosis ofM.tuberculosisinfection; IP-10 is a promi-sing marker. PLoS One, 2012,7(11): e43438.

[9] Essone PN, Chegou NN, Loxton AG, et al. Host cytokine responses induced after overnight stimulation with novelM.tuberculosisinfection phase-dependent antigens show promise as diagnostic candidates for TB disease. PLoS One, 2014,9(7): e102584.

[10] Frahm M, Goswami ND, Owzar K, et al. Discriminating between latent and active tuberculosis with multiple biomarker responses. Tuberculosis (Edinb), 2011,91(3): 250-256.

[11] Kellar KL, Gehrke J, Weis SE, et al. Multiple cytokines are released when blood from patients with tuberculosis is stimulated withMycobacteriumtuberculosisantigens. PLoS One, 2011,6(11): e26545.

[12] Murthy MK, Kaliappan T, Raja A. Cytokine and chemokine responses to selected early secreted antigenic target-6 and culture filtrate protein-10 peptides in tuberculosis. J Interferon Cytokine Res, 2011,31(3): 299-307.

[13] Skogstrand K, Thysen AH, Jørgensen CS, et al. Antigen-induced cytokine and chemokine release test for tuberculosis infection using adsorption of stimulated whole blood on filter paper and multiplex analysis. Scand J Clin Lab Invest, 2012,72(3): 204-211.

[14] Rivera-Ordaz A, Gonzaga-Bernachi J, Serafín-López J, et al.MycobacteriumtuberculosisBeijing genotype induces differential cytokine production by peripheral blood mononuclear cells of healthy BCG vaccinated individuals. Immunol Invest, 2012,41(2): 144-156.

[15] Holm LL, Rose MV, Kimaro G,et al. A comparison of interferon-γ and IP-10 for the diagnosis of tuberculosis. Pediatrics, 2014, 134(6): e1568-1575.

[16] Lighter J, Rigaud M, Huie M, et al. Chemokine IP-10: an adjunct marker for latent tuberculosis infection in children. Int J Tuberc Lung Dis, 2009,13(6): 731-736.

[17] Al-Attiyah R, El-Shazly A, Mustafa AS.Comparative analysis of spontaneous and mycobacterial antigen-induced secretion of Th1, Th2 and pro-inflammatory cytokines by peripheral blood mononuclear cells of tuberculosis patients. Scand J Immunol, 2012,75(6): 623-632.

[18] Jang S, Uzelac A, Salgame P. Distinct chemokine and cytokine gene expression pattern of murine dendritic cells and macrophages in response toMycobacteriumtuberculosisinfection. J Leukoc Biol, 2008,84(5): 1264-1270.

[19] Yu Y, Zhang Y, Hu S, et al. Different patterns of cytokines and chemokines combined with IFN-γ production reflectMycobacteriumtuberculosisinfection and disease. PLoS One, 2012, 7(9): e44944.

[20] Bai X, Chmura K, Ovrutsky AR, et al.Mycobacteriumtuberculosisincreases IP-10 and MIG protein despite inhibition of IP-10 and MIG transcription. Tuberculosis (Edinb), 2011, 91(1): 26-35.

[21] Hasan Z, Rao N, Salahuddin N, et al.MycobacteriumtuberculosisSonicate-Induced IFNγ, CXCL10 and IL10 can Differen-tiate Severity in Tuberculosis. Scand J Immunol, 2012,75(2):220-226.

[22] Zhang Y, Broser M, Rom WN.Activation of the interleukin 6 gene byMycobacteriumtuberculosisor lipopolysaccharide is mediated by nuclear factors NF-IL6 and NF-kappa B. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91(6): 2225-2229.

[23] Nakaya M, Yoneda T, Yoshikawa M, et al. The evaluation of interleukin-8 (IL-8) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) level in peripheral blood of patients with active pulmonary tuberculosis. Article in Japanese. Kekkaku, 1995,70(8): 461-466.

[24] Huang KH, Wang CH, Lin CH, et al. NF-κB repressing factor downregulates basal expression andMycobacteriumtuberculosisinduced IP-10 and IL-8 synthesis via interference with NF-κB in monocytes. J Biomed Sci, 2014, 21: 71.

[25] Fietta AM, Morosini M, Meloni F, et al. Pharmacological analysis of signal transduction pathways required forMycobacteriumtuberculosis-induced IL-8 and MCP-1 production in human peripheral monocytes. Cytokine, 2002,19(5): 242-249.

[26] Boggaram V, Gottipati KR, Wang X, et al. Early secreted antigenic target of 6 kDa (ESAT-6) protein ofMycobacteriumtuberculosisinduces interleukin-8 (IL-8) expression in lung epithelial cells via protein kinase signaling and reactive oxygen species. J Biol Chem, 2013, 288(35): 25500-25511.

[27] Higgins DM, Sanchez-Campillo J, Rosas-Taraco AG, et al. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection withMycobacteriumtuberculosis. J Immunol, 2008, 180(7): 4892-4900.

[28] Boussiotis VA, Tsai EY, Yunis EJ, et al. IL-10-producing T cells suppress immune responses in anergic tuberculosis patients. J Clin Invest, 2000, 105(9): 1317-1325.

[29] Olobo JO, Geletu M, Demissie A, et al. Circulating TNF-alpha, TGF-beta, and IL-10 in tuberculosis patients and healthy contacts. Scand J Immunol, 2001, 53(1): 85-91.

[30] Li H, Liang CZ, Tao YQ, et al. Elevated local TGF-β1 level predisposes a closed bone fracture to tuberculosis infection. Med Hypotheses, 2012,79(3): 400-402.

[31] Latorre I, Díaz J, Mialdea I, et al. IP-10 is an accurate biomarker for the diagnosis of tuberculosis in children. J Infect, 2014, 69(6): 590-599.

[32] Ruhwald M, Bodmer T, Maier C, et al. Evaluating the potential of IP-10 and MCP-2 as biomarkers for the diagnosis of tuberculosis. Eur Respir J, 2008, 32(6): 1607-1615.

(本文编辑：薛爱华)

Value ofMycobacteriumtuberculosisantigen-induced human peripheral blood cytokine regulatory network in the diagnosis of tuberculosis

CHENTao,CHENLiang,LIHai-cheng,GUOHui-xin,LINDong-zi,WANGWei,LIYu-mei,YULi,LIZhen-yan,SUNQi,HUANGXin-chun,LIGuo-zhou,ZHOUJie,ZHAOMei-gui,ZHONGQiu,ZHOULin.

CenterforTuberculosisControlofGuangdongProvince,Guangzhou510630,China

s:ZHONGQiu,Email:zhongqiu@vip.163.com;ZHOULin,Email:zhoulinpaper@vip.163.com;ZHAOMei-gui,Email:bazmg@126.com

Objective IFN-γ release assay (IGRA) is widely used for tuberculosis (TB) screening and diagnosis currently. But it can’t distinguish between active tuberculosis and latent tuberculosis (LTB). The aim of this study was to find more appropriate serum markers and their regulatory networks as alternatives to IFN-γ, for active tuberculosis diagnosis and tuberculosis latent infection screening. Methods Forty healthy control blood samples, 40 diagnosed pulmonary tuberculosis patients blood samples, 40 TB latent infected blood samples were stimulated with specific antigens ofMycobacteriumtuberculosisESAT-6 and CFP-10; the cytokines expression were profiled with human cytokine array; and the significant changes cytokines were used to cytokine regulation network construction. Results CCL1 (I-309), CXCL9 (MIG), IL10, IL6, CSF2, CSF3, IL8, IL1α, IL7, TGF-β1, CCL2, IL2, IL13, TNFα were significantly upregulated from 2.06 to 3.18 timesin patients with active pulmonary tuberculosis after tuberculosis specific antigen stimulation; CCL3, IL1β, CCL8, IFN-γ, CXCL10 were significantly upregulated from 2.44 to 11.56 times in the active tuberculosis and latent TB infection; CCL4 and MIP-1α were up-regulated in all these three groups afterMycobacteriumtuberculosisspecific antigen stimulation. Cytokine regulatory networks show that these up-regulated cytokines are mainly concentrated in the IFN-γ and IL1α regulatory networks. Conclusion CXCL10 (IP-10), CCL3, CCL8 and IL1β may be more suitable for tuberculosis or latent tuberculosis screening than IFN-γ.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Cytokines； Antigens, bacterial； Bacterial proteins； Biological markers

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.08.007

“十二五” 国家科技重大专项(2014ZX10003002-003)；广东省科技计划(2014A020212238)；广东省卫生科技项目(C2013008/C2012008)

510630 广州，广东省结核病控制中心(陈涛、陈亮、李海成、郭卉欣、孙琦，钟球、周琳)；深圳市宝市安区慢性病防治院结核病防治科(赵梅桂)；佛山市第四人民医院检验科(周杰、王威)；暨南大学医学院微生物与免疫教研室(黎贞燕、黄新春)；华南理工大学轻工食品学院(余丽)；东莞市慢性病防治院检验科(林东子、李玉美、李国周)

注：陈涛、陈亮对本研究具有同等贡献，为并列第一作者

周琳，Email：zhoulinpaper@163.com；钟球，Email：zhongqiu@vip.163.com; 赵梅桂，Email：bazmg@126.com

2015-07-03)