邓海清 杨蕾 陈成 王国治 陈国庆



·专家论坛·

结核病细菌学实验室设置要求探讨

邓海清 杨蕾 陈成 王国治 陈国庆

依据《实验室生物安全通用要求》对于生物安全实验室的规定和《结核病诊断实验室检验规程》对于结核病细菌学实验室的相关规定，探讨了生物安全二级实验(BSL-2)的基本要求，分析了目前关于BSL-2实验室存在的问题和不足，对从事结核分枝杆菌分离培养、涉及微生物学技术进行的结核分枝杆菌耐药检测与分型鉴定实验室提出改进的建议，解决该类实验室存在的生物安全隐患，提高生物安全防护措施，以期得到国家相关部门和同仁的支持。

结核分枝杆菌; 细菌学技术; 实验室; 安全措施

结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)是引起结核病的病原菌。结核病细菌学实验室检测主要实验过程涉及到结核分枝杆菌的微生物学、免疫学与分子生物学检测等，根据原卫生部公布的《人间传染的病原微生物名录》(以下简称《名录》)[1]，结核分枝杆菌危害程度分类属于高致病性的第二类病原微生物。结核分枝杆菌可通过呼吸道、消化道和破损的皮肤黏膜等多途径进入机体，可侵袭机体任何组织、器官引起进行性疾病，且耐药结核病难以治愈；进行结核分枝杆菌分离培养、涉及微生物学技术的结核分枝杆菌耐药检测与分型鉴定工作的实验室涉及范围广、环节多，实验室的安全防护是否得当直接关系到医务人员和科研工作者的个人健康，同时合理的实验室设置也减少了结核分枝杆菌污染环境的可能性。如何合理科学配置结核病细菌学实验室的设施与设备以确保其安全，是结核病相关医务人员和科研工作者必须面对的问题。

实验室基本要求与问题分析

依据《名录》对结核分枝杆菌不同实验活动所需生物安全实验室级别的规定，在实验室操作涉及到“大量”病原菌的制备，或易产生气溶胶的实验操作(如病原菌离心、冻干等)，以及结核分枝杆菌活菌感染的动物实验应在《实验室生物安全通用要求(GB19489-2008)》[2](以下简称《通用要求》)规定的三级生物安全实验室(BSL-3)或三级动物生物安全实验室(ABSL-3)进行。样本检测包括样本的病原菌分离纯化、药物敏感性试验(简称“药敏试验”)、生化鉴定、免疫学实验、PCR核酸提取、涂片、显微观察等初步检测和检验活动在BSL-2实验室进行，非感染性材料的不含致病性活菌材料的分子生物学、免疫学等实验可在BSL-1实验室进行。依据《名录》规定，在国内涉及面最广的临床结核病实验室检测工作在BSL-2实验室进行。目前，我国对生物安全实验室基本设施要求强制执行的标准有中华人民共和国住房和城乡建设部与中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局联合颁布的《生物安全实验室建筑技术规范》[3](GB 50346-2011)、中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局和中国国家标准化管理委员会发布的《通用要求》和中国防痨协会在1995年制定并于2006年再版修订的实验室常规操作标准《结核病诊断实验室检验规程》[4]，其基本要求如下。

一、BSL-2实验室建筑基本要求

1. 实验室建筑要求分类：生物安全实验室根据所操作致病性生物因子的传播途径可分为a类和b类。a类指操作非经空气传播生物因子的实验室；b类指操作经空气传播生物因子的实验室。b1类生物安全实验室指可有效利用安全隔离装置进行操作的实验室；b2类生物安全实验室指不能有效利用安全隔离装置进行操作的实验室。结核病检测实验室属b1类实验室。

图1 典型BSL-2实验室(图片来源于世界卫生组织《实验室生物安全手册(第三版)》[5])

2. 位置要求：BSL-2生物安全实验室宜实施一级屏障(操作者和被操作对象之间的隔离)和二级屏障(生物安全实验室和外部环境的隔离)；实验室与建筑物其他部分可相通，实验室的走廊和通道应不妨碍人员和物品通过。应设计紧急撤离路线，紧急出口应有明显的标识。

3. 其他要求：实验室选址、设计和建造应符合国家和地方环境保护和建设主管部门等的规定和要求。实验室的安全保卫、防火和安全通道设置应符合国家的消防规定和要求，同时应考虑生物安全的特殊要求；实验室的建筑材料和设备等应符合国家相关部门对该类产品生产、销售和使用的规定和要求。应有可靠的电力供应。必要时，重要设备(如：培养箱、生物安全柜、冰箱等)应配置备用电源。

二、BSL-2实验室设施基本要求

1. 基本布局：实验室基本布局如图1所示。BSL-2实验室在实验室门口处应设存衣或挂衣装置，可将个人服装与实验室工作服分开放置，靠近实验室出口宜设置洗手池，必要时应设紧急喷淋装置；实验室房间的入口处应有警示和进入限制及可视窗，房间的门根据需要安装门锁，门锁及门的开启方向应不妨碍室内人员逃生，门锁应便于内部快速打开。放置生物安全柜实验间的门应可自动关闭，生物安全柜放置应远离实验室入口。

2. 基础设施要求：实验室可以利用自然通风，如果采用机械通风，应避免交叉污染。如果有可开启的窗户，应安装可防蚊虫的纱窗；实验室应有防止节肢动物和啮齿动物进入的措施。应设应急照明装置。供水和排水管道系统应不渗漏，下水应有防回流设计。实验室内应避免不必要的反光和强光。实验室的室内环境参数应符合工作要求和卫生等相关要求，机械通风的实验室温度在18 ℃～27 ℃，相对湿度在30%～70%，噪声小于60 dB(A)，平均光照度300 lx。

3. 其他要求：实验室的墙壁、天花板和地面应易清洁、不渗水、耐化学品和消毒灭菌剂的腐蚀。地面应平整、防滑，不应铺设地毯。实验室台柜和座椅等应稳固，边角应圆滑。实验室台柜等摆放应便于清洁，实验台面应防水、耐腐蚀、耐热和坚固。实验室应有足够的空间和台柜等摆放实验室设备和物品。应根据工作性质和流程合理摆放实验室设备、台柜、物品等，避免相互干扰、交叉污染，并应不妨碍逃生和急救。

三、BSL-2实验室设备基本配置

1. 生物安全柜：BSL-2实验室应配备与其实验活动相匹配的生物安全柜，并按生物安全柜产品的设计要求安装和使用。如果生物安全柜的排风在室内循环，室内应具备通风换气的条件；如果使用需要管道排风的生物安全柜，应通过独立于建筑物其他公共通风系统的管道排出。

2. 灭菌消毒设备：应在实验室或其所在的建筑内配备高压蒸汽灭菌器或其他适当的消毒灭菌设备，所配备的消毒灭菌设备应以风险评估为依据。若操作刺激或腐蚀性物质，应在30 m内设洗眼装置。

四、BSL-2实验室存在的问题

1. 《名录》不符合《条例》规定：尽管《名录》明确规定包括药敏试验检测在内的病原微生物样本检测可在BSL-2实验室进行，但结核分枝杆菌药敏试验检测时已经分离并确定是结核分枝杆菌，根据国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》[6](本文简称《条例》)第二十一条规定生物安全一级、二级实验室不得从事高致病性病原微生物实验活动，《名录》的规定明显不符合《条例》规定。

2. 生物安全隐患：根据《通用要求》定义：生物安全实验室要求生物安全防护水平为二级的实验室适用于操作能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物；结核分枝杆菌从其分类来看，主要包括国际标准株H37Rv、其减毒株H37Ra和临床分离株等。临床分离株又包含敏感、单耐药、多耐药、广泛耐药、全耐药等结核分枝杆菌菌株，对于广泛耐药、全耐药结核分枝杆菌目前并无有效的治疗药物。近年来，关于结核病流行病学调查显示，我国是全球22个结核病高负担国家之一，患病人数仅次于印度，居世界第二位，其中耐多药结核病在我国的流行异常严重，流行比例为9.3%，约是世界平均水平(4.8%)的2倍[7]，耐多药结核病(MDR-TB)、广泛耐药结核病(XDR-TB)和全耐药结核病等的出现使得结核病的防控面临巨大的挑战，从现有的BSL-2实验室防护水平来看，存在很大的生物安全隐患，并不能满足结核分枝杆菌的细菌学检测等试验的要求。

3. 结核分枝杆菌获得性感染：关于结核病实验室研究人员感染或医院内相关医务人员感染的报道也是屡见不鲜，何广学、韩超楠等[8-9]对国内外结核分枝杆菌感染现状进行了总结分析，医务人员获得性肺结核比例显著高于一般人群，感染和患病风险明显高于普通人群；研究表明，医院内感染暴露因素比较复杂，我国还没有系统的医务人员感染结核分枝杆菌和患病筛查、合理的保护措施及有效的监督制度，以及有关这方面的流行病学研究及微生物环境监测，这些都有待进一步完善。国内学者就专门针对实验室获得性感染事件进行了统计研究[10]，结核分枝杆菌感染事件高达223例，证明了目前的实验室安全防护还需要进一步加强和改善。陆兵等[11]报道实验室获得性结核分枝杆菌感染主要为吸入感染，因设备故障或缺陷、锐器损伤或擦伤、操作失误、呼吸暴露(多数为未进行有效的呼吸防护)而造成感染。值得注意的是，所有实验室获得性结核分枝杆菌感染事件中，未见BSL-3实验室发生结核分枝杆菌感染的报道，未见充分呼吸防护后发生结核分枝杆菌感染的报道。这也说明了一个问题，现有的BSL-2实验室的设计与要求存在不足，普通的BSL-2 实验室对于结核分枝杆菌的感染不能进行有效的防护。

4. 建议：我国对BSL-3实验室硬件要求高于WHO生物安全手册的规定。而且，根据《条例》规定，建立BSL-3实验室应在国家生物安全实验室体系规划内并依法履行有关审批手续；要经国务院科技主管部门、环境保护主管部门审查同意；实验室建成后要通过认证认可监督管理部门确定的认可机构进行实验室认可；实验目的和拟从事的实验活动要通过国务院卫生主管部门审查。因此从事结核分枝杆菌检测均在BSL-3实验室进行并不现实。根据上述情况，结核分枝杆菌检测实验室需要加强生物安全防护而又无法在BSL-3实验室工作情况下，以世界卫生组织《实验室生物安全手册(第三版)》[5]中生物防护三级实验室为参考模板，建立符合中国国情的负压结核分枝杆菌检测BSL-2实验室是解决结核分枝杆菌检测实验室生物安全防护的有效方法。

实验室改进建议

一、负压结核分枝杆菌检测BSL-2实验室建筑与布局要求

实验室应与同一建筑内自由活动区域分隔开，具体可将实验室置于走廊的盲端，或设隔离区和隔离门。实验室宜设立双缓冲间(即双门通过间)，缓冲间和邻近空间应保持压差，缓冲间的门可自动关闭且互锁，配备有能击碎的面板供紧急撤离时使用，窗户应关闭、密封、防碎。在每个出口附近安装不需用手控制的洗手池或手消毒装置，生物安全柜的安装位置应远离人员活动区，且避开门和通风系统的交叉区，负压结核分枝杆菌检测实验室平面布局见图2。

图2 负压结核分枝杆菌检测BSL-2实验室示意图(图片来源于世界卫生组织《实验室生物安全手册(第三版)》[5])

二、负压结核分枝杆菌检测BSL-2实验室设施要求

防护实验室中应配置用于污染废弃物消毒的高压灭菌器，如果感染性废弃物需运出实验室处理，则必须根据国家或国际的相应规定，密封于不易破裂的、防渗漏的容器中；供水管必须安装防逆流装置；真空管道应采用装有液体消毒剂的防气阀和高效空气过滤器(high efficiency particulate air filter，HEPA)或相当产品进行保护；备用真空泵也应用防气阀和过滤器进行适当保护，实验室应密封；需建造空气管道通风系统以进行气体消毒；可视传递窗应设计为单向开启且有灭菌设备(如紫外灯等)，进入物品直接由传递窗进入，经过处理后的废弃物由传递窗传出并按规定处理；靠近走廊一侧或入口应设置为可视窗以方便实验室外人员观察实验室动态和安全情况或外来人员参观。

三、负压结核分枝杆菌检测BSL-2实验室空调净化系统基本要求

负压结核分枝杆菌检测实验室须建立可使空气定向流动的可控通风系统，以确保实验室内气流由缓冲间向核心工作区域定向流动。在构建通风系统时，应保证从生物安全实验室内所排出的空气不会逆流至该建筑物内的其他区域，空气经HEPA过滤后排出建筑以外。应安装直观的监测系统，以便工作人员可以随时确保实验室内维持正确的定向气流，该监测系统可带也可不带警报系统。可以安装取暖、通风和空调(Heating, ventilation and air conditioning，HVAC)控制系统来防止实验室出现持续正压，应考虑安装视听警报器，向工作人员发出HVAC系统故障信号。

四、负压结核分枝杆菌检测实验室安全柜选择与安装要求

1. 不涉及挥发性化学物质的安全柜选择：在实验室实验内容中不涉及挥发性化学物质时选择外排风式A2 型Ⅱ级生物安全柜，安全柜的设计使用“套管(thimble)”或“伞形罩(canopyhood)”连接。套管安装在安全柜的排风管上，将安全柜中需要排出的空气应通过独立于建筑物其他公共通风系统的管道排出。在套管和安全柜排风管之间保留一个直径差通常为2.5 cm 的小开口，以便让房间的空气也可以吸入到独立排风系统中，这种安全柜的开启或关闭不影响室内压力，节约能源且易于安装。

2. 涉及挥发性化学物质的安全柜选择：在实验室实验内容中涉及挥发性化学物质时选择Ⅱ级B2 型安全柜，也称为全排放型安全柜，可用于操作少量挥发性化学品和放射性核素。如果选择Ⅱ级B2 型生物安全柜，必须是连接到专门的排风系统，建筑物排风系统的排风量和静压必须与生产商所指定的要求完全一致。

结 论

由于结核分枝杆菌的特殊性，主要以空气传播、气溶胶感染为主，生物安全防护问题相对于其他病原微生物显得更为重要。目前国内大部分结核病专科医院、结核病防治所、疾病预防控制中心等的研究实验室多为BSL-2实验室，条件虽然有很大的改善，但离三级防护还有一定差距，因结核病患者或者含结核分枝杆菌活菌的标本较为集中，空气中结核分枝杆菌的含量也可能高于其他正常区域，存在发生医院内或者实验室内感染的风险，加之近年来越来越严重的耐药结核分枝杆菌的检出，大多数处于一线基层的实验人员感染结核分枝杆菌的风险远高于普通人群，对自身安全问题构成了严重的挑战。随着结核病患者的耐药率逐年升高，相关实验室的建设、设施的要求、人员的防护等一系列生物安全问题就应该成为首要问题。

考虑到BSL-3实验室从实验室选址、总体设计、设施要求甚至到水电气设施要求等都有明确的规定，要求极高，成本大大增加，鉴于中国的实际国情，需要将所有结核分枝杆菌细菌学检测实验室都按BSL-3实验室标准建设是不切实际的，目前有效的措施应该是对现有的BSL-2实验室设计与设施进行改造，建立符合中国国情的结核分枝杆菌BSL-2实验室。建立这样的负压实验室也需要花费不少人力、财力等，经费问题是首要问题。为了医务工作者和结核病相关研究人员的健康，更为了整个医疗事业的稳步发展，希望我国政府相关部门能够给予一定的经费支持，建议国家主管部门制定相关的补充规定，保证相关工作能够得到顺利实施。

[1] 中华人民共和国卫生部. 人间传染的病原微生物名录. 北京：中华人民共和国卫生部办公厅，2006：21-28.

[2] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会. 实验室生物安全通用要求(GB19489-2008). 北京：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会，2008: 6-10.

[3] 中华人民共和国住房和城乡建设部，中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局. 生物安全实验室建筑技术规范. 北京：中国建筑工业出版社，2011: 5-10.

[4] 中国防痨协会基础专业委员会. 结核病诊断实验室检验规程. 北京：中国教育文化出版社, 2006: 1-7.

[5] World Health Organization. Laboratory biosafety manual. 3rd ed. Geneva: World Health Organization, 2004: 14-21.

[6] 中华人民共和国国务院. 病原微生物实验室生物安全管理条例. 2004-11-12.

[7] 中华人民共和国卫生部. 全国结核病耐药性基线调查报告(2007—2008年). 北京:人民卫生出版社, 2009：1-10.

[8] 何广学, 熊勇超, 侯月云, 等. 国内外结核感染控制现状与对策. 结核病与肺部健康杂志, 2012, 1(1): 52-54.

[9] 韩超楠, 肖和平. 医院潜伏性结核分枝杆菌感染. 结核病与肺部健康杂志, 2012，1(1): 66-69.

[10] 周乙华, 庄辉. 实验室感染与生物安全. 中华预防医学杂志, 2005，39(3): 215-217.

[11] 陆兵, 刘秋焕, 王荣, 等. 结核分枝杆菌实验室获得性感染事件分析. 中国防痨杂志, 2012，34(5): 333-335.

(本文编辑：郭萌)

Discussion on the setup requirements of Mtb laboratory

DENG Hai-qing, YANG Lei, CHEN Cheng, WANG Guo-zhi, CHEN Guo-qing.

Division of Tuberculosis Vaccines, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

CHEN Guo-qing, Email: chengq@nicpbp.org.cn

According to the provisions of “Laboratories-GeneralRequirementsforBiosafety” for the biosafety laboratory and “TheTestProceduresofTuberculosisDiagnosticLaboratory” for theMycobacteriumtuberculosis(Mtb) bacteriology testing laboratories, in this paper we explore the basic requirements and shortcomings of the biosafety level Ⅱ(BSL-2) laboratory to offer some suggestions for the biosafety of Mtb bacteriology testing laboratory which can conduct Mtb isolating, culturing, drug susceptibility testing and genotyping and so on. It might contribute to similar settings and peers.

Mycobacteriumtuberculosis; Bacteriological techniques; Laboratories; Security measures

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.02.001

国家食品药品监督管理总局研究课题资助课题(M201405)

100050 北京，中国食品药品检定研究院结核疫苗室(邓海清、杨蕾、陈成、王国治、陈国庆)；温州医科大学环境与公共卫生学院(邓海清、陈成)

陈国庆，Email：chengq@nicpbp.org.cn

2014-11-20)