任连升，郝建兵，张蕾，郝丽荣

(哈尔滨医科大学附属第一医院肾内二科和血液透析中心，黑龙江 哈尔滨 150001)

醛固酮在腹膜透析大鼠腹膜纤维化中的作用*

任连升，郝建兵，张蕾△，郝丽荣

(哈尔滨医科大学附属第一医院肾内二科和血液透析中心，黑龙江 哈尔滨 150001)

目的:研究醛固酮在腹膜透析大鼠腹膜纤维化中的作用，以及醛固酮受体拮抗剂是否能够减轻腹膜纤维化。方法:通过腹腔注射脂多糖(第1、3、5、7天，0.6 mg/kg)+透析液(每天腹腔注射4.25%含糖透析液100 mL/kg)建立伴有腹膜纤维化的腹膜透析大鼠模型。同时给予醛固酮受体拮抗剂(螺内酯，100 mg·kg－1· d－1)灌胃。4周后取大鼠腹膜行病理和免疫组化检测，同时采用real－time PCR和Western blot法检测醛固酮合成酶(CYP11B2)、11β－羟基类固醇脱氢酶2型(11β－HSD2)、盐皮质激素受体(MCR)和炎症因子的表达情况。结果:成功建立伴有腹膜纤维化的腹膜透析大鼠模型，发现腹膜间皮细胞受损，形态改变，胶原纤维沉积，腹膜增厚，腹膜和腹透液中巨噬细胞浸润增多。与正常大鼠相比，腹膜上MCR、11β－HSD2和CYP11B2表达增高，醛固酮含量增多。同时腹膜上NF－κB/MCP－1表达增加。而给予螺内酯治疗后腹膜纤维化减轻，NF－κB/MCP－1表达减少。结论:局部产生的醛固酮可能通过NF－κB/MCP－1途径参与腹膜纤维化过程。醛固酮受体拮抗剂螺内酯能够减轻腹膜透析大鼠的腹膜纤维化程度。

腹膜纤维化;醛固酮;螺内酯

腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是一种有效治疗终末期肾脏病的方法。但在长期维持性腹膜透析过程中由于腹膜纤维化导致超滤功能丧失，腹膜透析失败。因此研究腹膜纤维化的发病机制对于防治和延长腹膜寿命具有重要作用。既往许多研究表明局部肾素－血管紧张素－醛固酮系统(renin－angioten－sin－aldosterone system，RAAS)的激活在许多组织器官纤维化中发挥重要作用，并且已证明血管紧张素与腹膜纤维化相关［1－3］。然而局部醛固酮是否以及如何参与腹膜纤维化的发生发展尚不清楚。因此，本研究通过建立腹膜透析大鼠纤维化模型来探讨醛固酮在腹膜纤维化中的作用。

材料和方法

1 动物

健康雄性SD大鼠，体重200～250 g，哈尔滨医科大学附属第一医院动物中心提供。每笼5只，饲养在恒温(22±2)℃、恒湿(55±5)%条件下，标准饲料和自由饮水。

2 主要试剂

兔抗鼠NF－κB(p65)、单核细胞趋化蛋白－1 (monocyte chemoattractant protein－1，MCP－1)、醛固酮合成酶CYP11B2、11β－羟基类固醇脱氢酶2型(11βhydroxysteroid dehydrogenase type 2，11β－HSD2)、盐皮质激素受体(mineralcorticoid receptor，MCR)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)和CD68/ED－1多克隆抗体购自Santa Cruz;山羊抗兔Ⅱ抗购自北京中杉金桥公司;RNeasy Mini提取试剂盒为Qiagen产品;逆转录试剂盒为Life Technologies产品;SYBR染料(TaKa－Ra);其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。所用引物由上海捷瑞生物技术有限公司设计合成。

3 主要方法

3.1 动物模型制备及分组健康雄性SD大鼠30只，随机分为3组，每组10只，正常组(control)、模型组(PD)和螺内酯(spironolactone)组(PD－S)。模型组和螺内酯组每日腹腔内注射4.25%透析液(100 mL/kg)，并在第1、3、5、7天腹腔注射脂多糖(0.6 mg/kg)，注射部位固定在左下腹。螺内酯组同时给予螺内酯(100 mg/kg)灌胃［4］。

3.2 标本留取10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹腔内注射4.25%透析液(100 mL/kg)，轻揉按摩大鼠腹部以使腹透液均匀地充满腹腔。1 h后沿腹白线剪开腹壁，用灭菌吸管吸腹水1 mL注于EDTA试管中留取做腹水检测。于右侧腹壁取壁层腹膜，用冰生理盐水冲洗后，部分甲醛固定，其余液氮速冻储存待测。取腹透液0.1 mL于血细胞计数板中测定细胞总数，部分标本4℃离心，沉淀涂片，瑞氏－姬姆萨染色后进行细胞分类，计算单核巨噬细胞的绝对数量。心脏取血，加入预先加有肝素的试管内离心，分离血浆－80℃冰箱储存。待测所有实验数据用大鼠处死时体重校正。

3.3 组织病理检查取石蜡包埋的腹膜组织，HE及Masson三色染色，光镜下观察病理改变。HPIAS－1000分析软件测量壁层腹膜厚度和胶原纤维面积。

3.4 免疫组化实验免疫组化法分析石蜡切片，3%过氧化氢孵育10 min，血清封闭，兔抗大鼠FN和ED－1抗体室温孵育1 h，滴加山羊抗兔II抗，室温孵育30 min，DAB显色，封片。免疫组化图像分析应用彩色病理图像免疫组化测量系统(HPIAS－1000)分析结果，随机取10个视野，测定平均积分吸光度值，计算巨噬细胞个数。

3.5 Real－time PCR实验按照总RNA提取试剂盒说明提取腹膜组织中RNA，通过逆转录试剂盒逆转录得到cDNA，建立20 μL反应体系，利用Roche Light Cycler 480 II系统进行real－time PCR，SYBR染料相对定量检测mRNA。引物序列如下:CYP11B2 (sense:5'－AACACTGCCGAGCTCAAGAT－3'，antisense:5'－CATCGGCTTGAGAAAAGGAG－3'，产物162 bp);MCR(sense:5'－ATGCAGTTAATGCCCCACTC－3'，antisense:5'－TTCCTTATTGGGGTCAGCAC－3'，产物166 bp);11β－HSD2(sense:5'－GAGAGGATGCTACAGACCACTTC－3'，antisense:5'－TGCCAACAACCAGACAAATACA－3'，产物199 bp);β－actin(sense: 5'－CGCCAACCGCGAGAAGAT－3'，antisense:5'－CGTCACCGGAGTCCATCA－3'，产物168 bp)。PCR过程按SYBR染料说明书在荧光定量仪上进行。

3.6 Western blotting实验提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量。各取30 μL样品上样进行SDS－PAGE，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入I抗，4℃孵育过夜，TBST洗涤3次。加入II抗37℃孵育45 min，TBST洗涤3次，ECL试剂盒进行化学发光检测。

3.7 醛固酮含量测定取血浆1 mL，壁层腹膜约50 mg，置于1.5 mL EP管内，采用放射免疫法测定血浆和壁层腹膜中的醛固酮含量。

4 统计学处理

采用SPSS 16.0软件包分析。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用单因素方差(One－way ANOVA)分析，采用LSD法进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 实验组大鼠存活状态

在预实验过程中发现大鼠在注射脂多糖后死亡率较高，模型建立成功后，大鼠的状态相对稳定，无死亡。因此在建立模型时随机选用40只大鼠(模型组和螺内酯组各20只)给予腹腔注射脂多糖，1周后模型组大鼠死亡8只，螺内酯组死亡6只。最后每组随机选择10只大鼠继续实验过程，到实验结束均无死亡。

2 组织学改变

光学显微镜下观察，正常大鼠壁层腹膜很薄，由一层线性扁平间皮细胞组成，而大网膜几乎没有炎症细胞浸润。模型组壁层腹膜间皮细胞变为圆形、柱形，出现坏死脱落，间皮细胞下基质明显增厚，大量成纤维样细胞及单核、巨噬细胞浸润，胶原蛋白过度沉积，大网膜内也出现大量的炎症细胞浸润。而螺内酯给药组大鼠壁层腹膜损伤减轻，基质炎症细胞浸润和胶原蛋白沉积明显减少，见图1、表1。

Figure 1.Histological images of the peritoneum(×200).A～C:hematoxylin－eosin(HE)staining of peritonium; D～F:HE staining of colic omentum.图1 腹膜组织学改变

表1 大鼠壁层腹膜中的胶原纤维面积Table 1.The areas of the fibroconnective tissue under the mesothelial cell layer(μm2.Mean±SD.n=10)

3 腹透液中细胞总数和单核巨噬细胞计数

正常组腹透液中的细胞总数较少，而模型组腹透液中的细胞总数和单核巨噬细胞计数显著高于对照组(P＜0.01)，螺内酯给药组则较模型组显著减少(P＜0.01)，见表2。

表2 腹透液中细胞总数和巨噬细胞数量Table 2.Macrophages in the peritoneal fluid(×108/L.Mean± SD.n=10)

4 壁层腹膜中单核巨噬细胞(ED-1阳性细胞)浸润

通过免疫组织化学研究发现，与对照组相比，模型组壁层腹膜中单核巨噬细胞(ED－1阳性细胞)浸润显著增加。螺内酯给药组的炎症细胞浸润明显减少。定量分析表明，螺内酯组单核巨噬细胞(ED－1阳性细胞)浸润明显低于模型组和正常组，见图2、表3。

Figure 2.Infiltration of macrophages in the peritonium following immunohistochemical staining(×200).The macrophages were identified by immunohistochemical staining of ED－1(brown).A:control group;B:PD group;C:PD－S group.图2 ED-1阳性巨噬细胞在壁层腹膜中浸润

5 壁层腹膜CYP11B2、11β-HSD2和MCR的表达情况

Real－timePCR和Westernblotting检测CYP11B2、11β－HSD2和MCR的mRNA和蛋白表达发现，在正常腹膜间皮细胞中仅有少量表达，而在模型组表达显著增加。与模型组相比，使用螺内酯后CYP11B2和11β－HSD2表达呈现下降趋势，而MCR变化不明显，见图3。

Figure 3.The expression of MCR，11β－HSD2 and CYP11B2 at mRNA and protein levels in the abdominal membrane.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05 vs PD group.图3 MCR、11β-HSD2和CYP11B2在壁层腹膜中的表达

6 壁层腹膜上NF-κB、MCP-1和FN的表达情况

正常大鼠的壁层腹膜上NF－κB、MCP－1和FN呈弱表达。半定量分析表明模型组大鼠壁层腹膜上NF－κB和MCP－1表达显著增加，并且MCP－1主要在间皮细胞中表达。给予螺内酯治疗后NF－κB和MCP－1表达明显减少。FN主要沉积在间皮细胞间和细胞下基质，模型组显著增加，使用螺内酯后FN表达减少，见图4、5和表3。

Figure 4.The protein expression of NF－κB and MCP－1 in the abdominal membrane.Mean±SD.n=10.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs PD group.图4 NF-κB和MCP-1在壁层腹膜中的表达

Figure 5.Immunohistochemical staining of FN(brown)on formalin－fixed paraffin－embedded sections(×200).图5 纤维连接蛋白在壁层腹膜中的表达

表3 大鼠壁层腹膜中巨噬细胞浸润和FN表达情况Table 3.Macrophage infiltration and the expression of FN in theabdominal membrane of rats(Mean±SD.n=10)

表4 大鼠血浆和壁层腹膜中的醛固酮含量Table 4.The level of aldosterone in the peritoneum and plasma (Mean±SD.n=10)

7 血浆和壁层腹膜中醛固酮的含量

正常大鼠的壁层腹膜中含有醛固酮，但含量很少。与正常组比较，模型组大鼠壁层腹膜醛固酮含量明显升高，而给予螺内酯后壁层腹膜中醛固酮含量明显降低。但是各组间血浆醛固酮含量差异无统计学意义，见表4。

讨论

腹膜纤维化是维持性腹膜透析的主要并发症之一，并最终导致腹膜透析失败。而反复发生的腹膜炎症是导致腹膜纤维化的主要原因。研究表明腹膜中浸润的白细胞和单核巨噬细胞能够释放氧自由基、蛋白酶、前列腺素、白三烯和细胞因子(TGF－β1、TNF－α、IL－1β、MCP－1和RANTES)等，这些物质进一步损害腹膜间皮的细胞，破环腹膜完整性，最终导致纤维化和功能丧失［5］。本实验通过模拟长期腹膜透析合并间歇性炎症刺激的腹膜纤维化大鼠模型，探讨腹膜纤维化机制。

既往研究证实醛固酮可以通过基因或非基因途径导致组织器官纤维化(心脏、肾脏等)，并且其主要作用是通过盐皮质激素受体实现的。而盐皮质激素受体存在于多种细胞中，与糖皮质激素和盐皮质激素具有相同的亲和力。正常血液中皮质醇的浓度是醛固酮的1 000多倍，为保证盐皮质激素效应的敏感性，某些细胞中还存在一种糖皮质激素代谢的关键酶11β－Hsd2，可以促进有活性的皮质醇转化为可的松，显著降低有活性的糖皮质激素浓度。这种酶主要在盐皮质激素靶组织(如肾脏和结肠)中表达，保护盐皮质激素受体的作用［6］。因此，只有在盐皮质激素受体和11β－Hsd2高水平表达的组织，盐皮质激素才能发挥作用。在我们的研究中发现腹膜纤维化大鼠腹膜中MCR和11β－Hsd2表达明显增加，表明盐皮质激素参与了腹膜纤维化过程。越来越多的研究表明RAAS系统尤其是醛固酮参与了多种疾病的发生发展，并且已经证实醛固酮(盐皮质激素)的合成分为经典的肾上腺途径和肾上腺外局部合成途径，后者以旁分泌和自分泌的方式在局部发挥作用。因此局部RAAS系统直接参与了疾病的发生发展，而且CYP11B2是醛固酮合成过程的一种关键酶。我们研究发现纤维化的腹膜组织上CYP11B2表达显著上调，并且腹膜组织中的醛固酮含量明显增加，从而表明局部醛固酮活性增加，同时伴有腹膜纤维化，应用螺内酯后，腹膜纤维化减轻。因此，我们认为醛固酮可能在腹膜纤维化中发挥重要作用。

醛固酮究竟通过何种途径参与组织器官的纤维化过程呢?有研究表明醛固酮可以在心脏组织通过NF－кB途径诱导MCP－1表达从而导致纤维化［7］。而螺内酯(醛固酮受体拮抗剂)能够通过抑制TGF－β1、MCP－1和ROS过度表达，延缓心脏和肾脏纤维化的进展［8－10］。NF－κB上调MCP－1表达，诱导单核/巨唾细胞的浸润及激活，促进炎症反应，进而导致纤维化。因此，我们推测NF－κB/MCP－1可能参与了腹膜纤维化过程。我们研究发现纤维化的腹膜上NF－κB和MCP－1表达显著上调，腹膜和腹透液中的巨噬细胞显著增加。螺内酯组大鼠腹膜上的NF－κB和MCP－1表达减少，巨噬细胞浸润减少，并且纤维化程度也减轻。既往研究表明急性和慢性炎症均可诱导巨噬细胞局部浸润激活导致组织损伤［11］。Vernon等［12］研究肾脏纤维化时发现肾脏组织中浸润活化的巨噬细胞肾脏纤维化发生发展中发挥重要作用。因此，我们推测巨噬细胞可能通过产生炎症因子进一步诱导巨噬细胞浸润活化导致间皮细胞损伤，最终导致腹膜纤维化。

综上所述，我们在实验中发现模型组大鼠腹膜组织中醛固酮含量、MCR和11β－HSD2表达明显增加，NF－κB/MCP－1上调，巨噬细胞浸润增加，纤维化程度加剧，而预先给予螺内酯后腹膜纤维化程度减轻。这些结果表明腹膜中RAAS系统激活参与了腹膜纤维化过程，局部醛固酮通过NF－κB/MCP－1途径诱导激活炎症细胞，导致腹膜纤维化。

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［12］Vernon MA，Mylonas KJ，Hughes J.Macrophages and renal fibrosis［J］.Semi Nephrol，2010，30(3):302－317.

Effect of aldosterone on rat peritoneal fibrosis induced by peritoneal dialysis

REN Lian－sheng，HAO Jian－bing，ZHANG Lei，HAO Li－rong

(Department of Nephrology and Hemodialysis Center，The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University，Harbin 150001，China.E-mail:zhllb1996@163.com)

AIM:To investigate the pathologic role of aldosterone and protective effect of aldosterone receptor antagonist on peritoneal fibrosis in peritoneal dialysis rats.METHODS:A peritoneal fibrosis rat model was established by intraperitoneal injection of lipopolysaccharide(at 1 d，3 d，5 d and 7 d，0.6 mg/kg)and dialysate(daily intraperitoneal injection of 4.25%dialysate，100 mL/kg).At the same time，spironolactone(an aldosterone receptor antagonist，100 mg ·kg－1·d－1)was given to the model rats.After 4 weeks，the expression of aldosterone synthase CYP11B2，11β－hydroxysteroid dehydrogenase type 2(11β－HSD2)，mineralocorticoid receptor(MCR)，and inflammatory factors were detected by immunohistochemistry，real－time PCR and Western blotting.RESULTS:The rat model of peritoneal fibrosis was successfully established.At the same time，the injury of mesothelial cells，deposition of collagen fibers and thickness of peritoneal were increased.Moreover，the infiltration of macrophages in the peritoneum/dialysate was increased.The level of aldosterone and the expression of MCR，11β－HSD2 and CYP11B2 in fibrotic peritoneum were obviously up－regulated as compared with normal rats.The expression of NF－κB/MCP－1 was also increased.However，treatment with spironolactone alleviated peritoneal fibrosis and reduced the expression of NF－κB/MCP－1.CONCLUSION:Local aldosterone is involved in the process of peritoneal fibrosis via NF－κB/MCP－1 pathway.Spironolactone alleviates peritoneal fibrosis of peritoneal dialysis.

Peritoneal fibrosis;Aldosterone;Spironolactone

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.024

1000－4718(2015)02－325－06

2014－07－11

2014－11－20

哈尔滨医科大学附属第一医院院基金资助项目(No.2012YB009)

△通讯作者Tel:0451－85555592;E－mail:zhllb1996@163.com